一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用与流程
本发明属于干细胞，涉及一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用。
背景技术：
1、mscs最先来源于骨髓，但由于其各项潜能受年龄影响较大，且其分离过程具有侵入性，易导致感染、出血。胎盘来源充足、获取无需侵入性操作、使用时也无需担心伦理问题，如今已成为间充质干细胞（mscs）的重要来源，其中蜕膜间充质干细胞就来源于胎盘组织中的蜕膜层。来自胎盘底蜕膜的人蜕膜间充质干细胞(decidua basalis-derivedmesenchymal stem cells, db-mscs)属于间充质干细胞（mscs）的其中一个类别，与间充质干细胞（mscs）同样具有未分化细胞特性，能高效率自我更新，并且具有多向分化潜能等优点，在美容、抗衰老、产后恢复、妇女疾病（如卵巢早衰、卵巢癌）、组织再生、免疫系统疾病及移植修复受损器官等方面具有显著效果。
2、然而，目前人蜕膜间充质干细胞分离及扩增方法较杂，无统一有效的标准，使得其难以满足实际应用的诸多需求。举例来说，通过现有的分离培养方式所获取的人蜕膜间充质干细胞，在分离过程中各种细胞成分混杂在一起，其纯度往往难以达到理想的水平；此外，各种酶在短时间内直接对组织进行消化以获取人蜕膜间充质干细胞的操作，不可避免地会对细胞造成一定程度的损伤；再者，当前的培养方法使得细胞生长增殖的倍数较低，培养周期较长，这一方面增加了时间成本，另一方面也限制了其大规模应用的可能性。虽然现阶段已有专利在分离和培养过程中使用到胎牛血清，但胎牛血清存在潜在的病原体风险，在临床应用上仍然存在阻碍。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用，本发明提供一种合适的酶浓度及酶组合隔夜消化人蜕膜组织，通过二次消化方式处理人蜕膜组织，再利用特殊培养基进行培养，取消了震荡摇床的使用，不仅能有效分解组织促进干细胞释放，缩短培养周期，减少细胞损伤提高存活率和活性，而且培养基无异源成分、操作方便、成本较低，可满足细胞治疗及临床有关的应用需求。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，所述培养方法为清洗分离、组织处理、蜕膜层的分离和处理、进行两次消化、接种培养、换液传代、终止消化、冻存储存；
4、所述进行两次消化即离心后取组织沉淀加入特殊培养基中，再加入终浓度为0.8-1.2g/l的ⅱ型胶原酶和终浓度为0.1-0.3g/l的中性蛋白酶得到组织悬液，将组织悬液加入培养瓶中置于培养箱中隔夜消化12-28h后，再加入终浓度为0.5-1.0g/l的重组酶，消化5-15min，得到组织消化悬液。
5、进一步地，所述清洗分离即将胎盘先后用0.9%生理盐水、三抗清洗3遍后分离，分离后放入装有生理盐水的培养皿中，用无菌镊子去除粘连在组织上的血渍。
6、进一步地，所述组织处理即用无菌手术剪将组织分离成2-5cm2大小的组织片，平铺放入装有含1%三抗的培养皿中，静置灭菌5min。
7、进一步地，所述蜕膜层的分离和处理即用生理盐水清洗3遍组织片后分离蜕膜层，将分离好的蜕膜层，放入装有含1%三抗的培养皿中，静置灭菌5min，再用生理盐水清洗3遍蜕膜层组织，用新的无菌剪刀将组织剪至1-3mm3大小的组织碎，以400-600g离心5-15min。
8、进一步地，所述两次消化培养中组织沉淀和特殊培养基的体积比为2:15-21。
9、进一步地，所述接种培养即将组织消化悬液于400-600g下离心5-15min后去上清，在培养瓶中加入细胞组织悬液、特殊培养基、终浓度为100u/ml的青霉素、终浓度为100u/ml的链霉素和终浓度为100u/ml的两性霉素b，置于37℃、5%co2培养箱中培养，得到p0代。
10、进一步地，所述换液传代即于培养第2天、第5天时全量换液，培养至细胞融合度达到75-85%，去上清，用0.9%生理盐水清洗1遍后，用0.125%胰酶消化2-5min，用特殊培养基终止消化，再用100μm滤网过滤，获得细胞消化悬液，计数后于200-400g离心5-15min，用特殊培养基重悬细胞悬液后用t175培养瓶培养，得到p1代。
11、进一步地，所述终止消化即在培养至细胞融合度达到75-85%，去上清，用0.9%生理盐水清洗1遍后，用0.125%胰酶消化2-5min，用特殊培养基终止消化，获得细胞消化悬液，计数后于200-400g离心5-15min。
12、进一步地，所述冻存储存中的冻存液由dmso、人血白蛋白、特殊培养基按照质量比1:1:8组成，所述冻存密度为5-8×106cells/ml。
13、进一步地，所述特殊培养基以dmem高糖型培养基作为基底，添加5-15%血小板裂解液、300-360ng/ml纤维连接蛋白、5-25g/l血清白蛋白、15-25ng/ml人碱性成纤维生长因子、4mmol的l-谷氨酰胺、0.5-1.2×107cells/ml人脐带间充质干细胞裂解液；
14、所述人脐带间充质干细胞裂解液的制备方法为，准备水浴锅，设置温度为37℃；准备液氮，取人脐带间充质干细胞，反复冻融3-5次，于1200-1800g离心5-15min，取上清，得到人脐带间充质干细胞裂解液。
15、本发明的有益效果：
16、（1）本发明提供一种合适的酶浓度及酶组合隔夜消化人蜕膜组织，取消了震荡摇床的使用，不仅能有效分解组织促进干细胞释放，减少细胞损伤提高存活率和活性，而且操作方便、成本较低。
17、（2）本发明提供一种二次消化方式处理人蜕膜组织，能深入分解残留组织提高细胞收获率，去除杂质和细胞碎片，优化细胞质量。
18、（3）本发明提供一种特殊培养基，以dmem高糖型培养基为基底，添加血小板裂解液、纤维连接蛋白、血清白蛋白、人碱性成纤维生长因子、l-谷氨酰胺和人脐带间充质干细胞裂解液配制而成，其中的人脐带间充质干细胞裂解液含有多种活性物质，可以与蜕膜间充质干细胞相互作用，促进细胞的增殖、分化和自我更新，对增强细胞的生物学功能及生长增殖有一定的积极影响；人血小板裂解液由富含血小板的血浆纯化萃取而成，血小板来源的生长因子对细胞的分化和增殖起促进作用，且无异源添加物；纤维连接蛋白可以与细胞膜表面的特异性膜受体相结合，从而促进细胞的贴壁连接和生长，还可促进细胞增殖；血清白蛋白能够维持细胞正常的生理状态，增强细胞抗氧化能力，对细胞损伤有保护作用；人碱性成纤维生长因子作为一种多功能蛋白质,对细胞的增殖、分化和成纤维作用具有重要的调节作用；l-谷氨酰胺为蛋白质、核酸等合成提供碳源、氮源，可以促进干细胞的生长，维持细胞的生命活动；该特殊培养基使得细胞在爬出后可以快速贴壁生长，有效缩短培养周期，经收获的细胞活性好，增殖能力强，增殖潜力大，且本培养基无异源成分，可满足细胞治疗及临床有关的应用需求。
技术特征：
1.一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述培养方法为清洗分离、组织处理、蜕膜层的分离和处理、进行两次消化、接种培养、换液传代、终止消化、冻存储存；
2.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述清洗分离即将胎盘先后用0.9%生理盐水、三抗清洗3遍后分离，分离后放入装有生理盐水的培养皿中，用无菌镊子去除粘连在组织上的血渍。
3.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述组织处理即用无菌手术剪将组织分离成2-5cm2大小的组织片，平铺放入装有含1%三抗的培养皿中，静置灭菌5min。
4.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述蜕膜层的分离和处理即用生理盐水清洗3遍组织片后分离蜕膜层，将分离好的蜕膜层，放入装有含1%三抗的培养皿中，静置灭菌5min，再用生理盐水清洗3遍蜕膜层组织，用新的无菌剪刀将组织剪至1-3mm3大小的组织碎，以400-600g离心5-15min。
5.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述两次消化培养中组织沉淀和特殊培养基的体积比为2:15-21。
6.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述接种培养即将组织消化悬液于400-600g下离心5-15min后去上清，在培养瓶中加入细胞组织悬液、特殊培养基、终浓度为100u/ml的青霉素、终浓度为100u/ml的链霉素和终浓度为100u/ml的两性霉素b，置于37℃、5%co2培养箱中培养，得到p0代。
7.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述换液传代即于培养第2天、第5天时全量换液，培养至细胞融合度达到75-85%，去上清，用0.9%生理盐水清洗1遍后，用0.125%胰酶消化2-5min，用特殊培养基终止消化，再用100μm滤网过滤，获得细胞消化悬液，计数后于200-400g离心5-15min，用特殊培养基重悬细胞悬液后用培养瓶培养，得到p1代。
8.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述终止消化即在培养至细胞融合度达到75-85%，去上清，用0.9%生理盐水清洗1遍后，用0.125%胰酶消化2-5min，用特殊培养基终止消化，获得细胞消化悬液，计数后于200-400g离心5-15min。
9.根据权利要求1所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述冻存储存中的冻存液由dmso、人血白蛋白、特殊培养基按照质量比1:1:8组成，所述冻存密度为5-8×106cells/ml。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述特殊培养基以dmem高糖型培养基作为基底，添加5-15%血小板裂解液、300-360ng/ml纤维连接蛋白、5-25g/l血清白蛋白、15-25ng/ml人碱性成纤维生长因子、4mmol的l-谷氨酰胺、0.5-1.2×107cells/ml人脐带间充质干细胞裂解液；
技术总结
本发明涉及一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用，属于干细胞技术领域。所述培养方法为清洗分离、组织处理、蜕膜层的分离和处理、进行两次消化、接种培养、换液传代、终止消化、冻存储存。本发明提供一种合适的酶浓度及酶组合隔夜消化人蜕膜组织，通过二次消化方式处理人蜕膜组织，再利用特殊培养基进行培养，取消了震荡摇床的使用，不仅能有效分解组织促进干细胞释放，缩短培养周期，减少细胞损伤提高存活率和活性，而且培养基无异源成分、操作方便、成本较低，可满足细胞治疗及临床有关的应用需求。
技术研发人员：汪江浩,江颖纯,郭爱红,姜舒,赵传鑫,谢亮,张芸,谢元进,李欣,莫喜婷,邹沛华,吴艳
受保护的技术使用者：深圳市茵冠生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5