一种脓毒症耐药基因检测引物组合物及试剂盒的制作方法
本发明属于基因检测试剂盒的，涉及一种脓毒症耐药基因检测引物组合物及试剂盒。
背景技术：
1、脓毒症是一种由感染引起全身炎症反应综合症，常见于严重创伤或感染性疾病的患者。发病原因包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等引起的感染，导致机体炎症反应及免疫调节失衡。
2、引起脓毒症的病原微生物主要包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及其他革兰氏阴性杆菌等，这些病原微生物中往往存在耐药基因，脓毒症病原微生物中的耐药基因在脓毒症的治疗中是一个重大挑战，因其可导致抗生素治疗失败，需要在治疗时先确定样本中含有的耐药基因，再选择合适的药物，以达到最佳治疗效果。
3、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，lamp）是一种高效、简便、高特异性的核酸扩增技术，无需热循环设备即可在恒温条件下完成。该技术利用特异性引物和链置换dna聚合酶，在等温条件下进行高效快速的基因扩增和检测。lamp技术广泛应用于病原体检测、食品安全检测等领域。
4、然而，目前的lamp技术在实际应用中还存在一些问题，比如引物的非特异性扩增、反应体系稳定性较差等，并且难以真正意义上实现高通量检测。
5、由于上述问题，目前针对脓毒症耐药基因的检测技术，难以做到同时对十多种主要脓毒症耐药基因进行稳定高效且高特异性检测，这是由于不同的引物组恒温扩增成环效率差别较大，难以实现在相同的系统条件下扩增效率相近。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种脓毒症耐药基因检测引物组合物及试剂盒，具有能同时对十多种脓毒症耐药基因进行稳定、高效、高特异性检测的特点。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种脓毒症耐药基因检测引物组合物，包括耐碳青霉烯类基因：kpc、imp、ndm、oxa-48-like、vim和ges，耐氨基糖苷类基因：aac、aph、ant和arma以及耐甲氧西林类基因：meca和mecc的检测引物组，所述检测引物组由上游环引物lf或下游环引物lb中的一种或多种，除了所述arma和所述mecc检测引物组，所述arma和所述mecc检测引物组中不包括所述lf和所述lb，上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip组成，核苷酸序列如下：
4、kpc检测引物组：seq id no:1至seq id no:5；
5、imp检测引物组：seq id no:6至seq id no:10；
6、ndm检测引物组：seq id no:11至seq id no:16；
7、oxa-48-like检测引物组：seq id no:17至seq id no:21；
8、vim检测引物组：seq id no:22至seq id no:26；
9、ges检测引物组：seq id no:27至seq id no:31；
10、aac检测引物组：seq id no:32至seq id no:36；
11、aph检测引物组：seq id no:37至seq id no:41；
12、ant检测引物组：seq id no:42至seq id no:47；
13、arma检测引物组：seq id no:48至seq id no:51；
14、meca检测引物组：seq id no:52至seq id no:56；
15、mecc检测引物组：seq id no:57至seq id no:60。
16、优选的，还包括内标基因hbb检测引物，核苷酸序列如下：seq id no:61至seq idno:66。
17、一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，包括6片芯片、5 ml裂解液、0.5 ml内标溶液、1ml阴性对照溶液、1 ml阳性对照溶液和12张芯片封口膜，所述芯片设置有多个反应池，所述反应池内分别包埋有权利要求1所述脓毒症耐药基因检测引物组合物中的一种。
18、优选的，所述反应池内包埋的所述检测引物组的比例为f3：b3：fip：bip：lf：lb为1：1：5~8：5~8：3：3。
19、优选的，所述芯片内包埋有反应试剂，所述反应试剂包括冻干蛋白酶k、第一清洗液100~400 μl 、第二清洗液100~400 μl、洗脱液60~120 μl和恒温扩增反应冻干球。
20、优选的，所述第一清洗液由浓度0.01~0.2 m的氯化钠nacl和百分比浓度20~60%的异丙醇组成，所述第二清洗液为百分比浓度40~80%的无水乙醇，洗脱液为1×te buffer。
21、优选的，所述恒温扩增反应冻干球由浓度10 mm的脱氧核糖核苷三磷酸dntp、百分比浓度5%的牛血清白蛋白bsa、浓度5 m的硫酸镁mgso4、浓度100 μm的荧光染料、浓度5 m的甜菜碱和浓度8 u/μl的bst dna聚合酶组成，配制比例为2：3~5：1：1：2~4：1~3，所述bst dna聚合酶的扩增浓度为0.3~3 u/μl。
22、优选的，所述裂解液由浓度50~100 mm的乙二胺四乙酸edta、浓度3~5 m的盐酸胍、百分比浓度10~20%的tween-20和百分比浓度1~5%的十二烷基硫酸钠sds组成。
23、优选的，所述内标溶液为含内标基因hbb片段的甘油菌溶液，所述阴性对照溶液为生理盐水，所述阳性对照溶液为含耐碳青霉烯类基因：kpc、imp、ndm、oxa-48-like、vim和ges，耐氨基糖苷类基因：aac、aph、ant和arma以及耐甲氧西林类基因：meca和mecc片段中的一种或多种的混合甘油菌溶液。
24、本发明中的arma检测引物组和mecc检测引物组中不包括上游环引物lf和下游环引物lb，这两组引物组由上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip组成，其余10组检测引物组由上游环引物lf或下游环引物lb中的一种或多种、上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip组成。
25、本发明使用lamp法进行核酸扩增，可在60～65℃恒温条件下进行核酸扩增，扩增速度快，从反应到检测时间仅需15～60 min，且不需要复杂的设备，操作简便，检测效率提高。
26、本发明分别针对12种脓毒症耐药基因的6个区域设计引物组合物，特异性识别每种耐药基因上的多个独立区域，提高对耐药基因检测的特异性和灵敏度，保证检测结果的准确性，能够在1 h内快速甄别出耐药基因，从而能够针对耐药基因去选择最适药物，对于临床治疗具有重要意义。
27、本发明使用芯片为核酸检测集成式微流控芯片，所述芯片包括混匀池、加样孔、第一液囊、第二液囊、第三液囊、样本池、吸附柱、废液池、内标池、阴性池、预留池和反应池；样本池中包埋有冻干蛋白酶k；第一液囊中包埋有第一清洗液，第二液囊中包埋有第二清洗液，第三液囊中包埋有洗脱液，三个液囊中分别包埋有不同反应试剂，试剂之间在进行实验操作前不会相互污染，保证反应的准确性；液囊下设置有刺破机构，通过下压液囊使其底部被刺破，即可以释放液囊中的反应试剂，操作简单；芯片设置有混匀池，混匀池中包埋有恒温扩增反应冻干球，可使样本与反应试剂充分混匀，保证后续恒温反应的稳定性；混合后的样本通过离心，按顺序注入反应池，确保进入各反应池的样本量均一，提高检测的稳定性和准确性；内标池中包埋有内标基因hbb检测引物，反应池设置有多个，分别包埋有十二种脓毒症耐药基因检测引物组中的一种，本芯片可同时检测十二种脓毒症耐药基因，检测通量大，效率高，大幅度降低检测单个耐药基因的平均成本。
28、本发明自带有内标溶液、阴性对照溶液和阳性对照溶液，并设置内标池和阴性池，能够对核酸提取和恒温扩增过程进行全称监控，保证样本检测的准确性，防止因试剂问题导致的检测结果不准确。
29、本发明使用的样本可为血液、痰液和肺泡灌洗液，痰液和肺泡灌洗液样本经常会存在块状物，影响检测结果，针对痰液和肺泡灌洗液样本，本发明只需少量样本，并通过naoh对样本进行液化，减少影响因素，血液样本中的干扰物较多，且病原体浓度较低，会影响检测结果，本发明通过甘露糖结合凝集素对血液样本中的病原体进行特异性富集，提高病原体浓度，且对总体反应体系进行优化，提高了检测的灵敏性，针对各病原微生物的检测灵敏度高，均达到100拷贝/ml。
30、本发明的有益效果：
31、本发明能够特异性识别每种耐药基因上的多个独立区域，提高对耐药基因检测的特异性和灵敏度，保证检测结果的准确性，使用lamp法进行核酸扩增，操作简便，检测效率高，能够在1 h内快速甄别出耐药基因，从而能够针对耐药基因去选择最适药物，对于临床治疗具有重要意义；
32、本发明使用芯片为核酸检测集成式微流控芯片，液囊中分别包埋有不同反应试剂，试剂之间在进行实验操作前不会相互污染，保证反应的准确性，芯片设置有混匀池，样本与反应试剂充分混匀，保证后续恒温反应的稳定性，混合后的样本通过离心，按顺序注入反应池，确保进入各反应池的样本量均一，提高检测的稳定性和准确性，反应池设置有多个，可同时检测十二种脓毒症耐药基因，检测通量大，效率高，大幅度降低检测单个耐药基因的平均成本；
33、本发明自带有内标溶液、阴性对照溶液和阳性对照溶液，能够对核酸提取纯化和恒温扩增过程进行全称监控，保证样本检测的准确性，防止因试剂问题导致的检测结果不准确，使用的样本为血液、痰液和肺泡灌洗液，痰液和肺泡灌洗液这两类样本经常会存在块状物，影响检测结果，本发明只需少量样本，并通过naoh对样本进行液化，减少影响因素，血液样本中的干扰物较多，且病原体浓度较低，会影响检测结果，本发明通过甘露糖结合凝集素对血液样本中的病原体进行特异性富集，提高病原体浓度，且对总体反应体系进行优化，提高了检测的灵敏性。
技术特征：
1.一种脓毒症耐药基因检测引物组合物，其特征在于：包括耐碳青霉烯类基因：kpc、imp、ndm、oxa-48-like、vim和ges，耐氨基糖苷类基因：aac、aph、ant和arma以及耐甲氧西林类基因：meca和mecc的检测引物组，所述检测引物组由上游环引物lf或下游环引物lb中的一种或多种，除了所述arma和所述mecc检测引物组，所述arma和所述mecc检测引物组中不包括所述lf和所述lb，上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip组成，核苷酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种脓毒症耐药基因检测引物组合物，其特征在于：还包括内标基因hbb检测引物，核苷酸序列如下：seq id no:61至seq id no:66。
3.一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于，包括6片芯片、5 ml裂解液、0.5 ml内标溶液、1 ml阴性对照溶液、1 ml阳性对照溶液和12张芯片封口膜，所述芯片设置有多个反应池，所述反应池内分别包埋有权利要求1所述脓毒症耐药基因检测引物组合物中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于：所述反应池内包埋的所述检测引物组的比例为f3：b3：fip：bip：lf：lb为1：1：5~8：5~8：3：3。
5.根据权利要求3所述的一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于：所述芯片内包埋有反应试剂，所述反应试剂包括冻干蛋白酶k、第一清洗液100~400 μl 、第二清洗液100~400 μl、洗脱液60~120 μl和恒温扩增反应冻干球。
6.根据权利要求5所述的一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于：所述第一清洗液由浓度0.01~0.2 m的氯化钠nacl和百分比浓度20~60%的异丙醇组成，所述第二清洗液为百分比浓度40~80%的无水乙醇，洗脱液为1×te buffer。
7.根据权利要求5所述的一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于：所述恒温扩增反应冻干球由浓度10 mm的脱氧核糖核苷三磷酸dntp、百分比浓度5%的牛血清白蛋白bsa、浓度5 m的硫酸镁mgso4、浓度100 μm的荧光染料、浓度5 m的甜菜碱和浓度8 u/μl的bstdna聚合酶组成，配制比例为2：3~5：1：1：2~4：1~3，所述bst dna聚合酶的扩增浓度为0.3~3u/μl。
8.根据权利要求3所述的一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于：所述裂解液由浓度50~100 mm的乙二胺四乙酸edta、浓度3~5 m的盐酸胍、百分比浓度10~20%的tween-20和百分比浓度1~5%的十二烷基硫酸钠sds组成。
9.根据权利要求3所述的一种脓毒症耐药基因检测试剂盒，其特征在于：所述内标溶液为含内标基因hbb片段的甘油菌溶液，所述阴性对照溶液为生理盐水，所述阳性对照溶液为含耐碳青霉烯类基因：kpc、imp、ndm、oxa-48-like、vim和ges，耐氨基糖苷类基因：aac、aph、ant和arma以及耐甲氧西林类基因：meca和mecc片段中的一种或多种的混合甘油菌溶液。
技术总结
本发明涉及一种脓毒症耐药基因检测引物组合物及试剂盒，属于基因检测试剂盒技术领域。本发明分别针对12种脓毒症耐药基因的6个区域设计引物组合物，特异性识别每种耐药基因上的多个独立区域，提高对耐药基因检测的特异性和灵敏度，保证检测结果的准确性，能够在1 h内快速甄别出耐药基因，从而能够针对耐药基因去选择最适药物，对于临床治疗具有重要意义。本发明使用芯片为核酸检测集成式微流控芯片，所述芯片包括混匀池、加样孔、第一液囊、第二液囊、第三液囊、样本池、吸附柱、废液池、内标池、阴性池、预留池和反应池；本发明具有能同时对十多种脓毒症耐药基因进行稳定、高效、高特异性检测的特点。
技术研发人员：李杨,任杰,许轶,李亚南,远义平,杨波
受保护的技术使用者：上海速创诊断产品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5