一种用于HPgV-1病毒LAMP检测的试剂盒的制作方法

本发明属于病毒检测，具体地，涉及一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒。

背景技术：

1、人类pegivirus-1（hpgv-1）是一种广泛流行的黄病毒科单链正向rna病毒，主要通过输血、注射吸毒、经皮损伤及性接触等途径传播。全球约1/6的人口呈现hpgv-1血清学阳性，其在不同国家和地区的流行率存在显著差异。hpgv-1感染在普通人群中的流行率为0.8%-44.6%，而在高危人群如注射吸毒者和男男性行为者中的感染率则更高，达到1.8%-75.3%。尽管hpgv-1通常被认为是一种不致病且可能有益的病毒，但其在与hiv-1共感染时能提高艾滋病人的生存率，这引发了对其在其他人类疾病中可能发挥的积极作用的关注。

2、目前，检测hpgv-1感染最常用的方法是rt-pcr，该方法通过逆转录hpgv-1 rna病毒为cdna，再以cdna为模板进行pcr扩增，扩增产物通过凝胶电泳即可判读结果。rt-pcr方法具有较高的准确性，能够检测hpgv-1病毒血症患者血清或血浆及体液中的hpgv-1-rna。然而，rt-pcr方法存在检测周期长、速度慢的问题，且需要复杂的实验设备和专业操作技能，限制了其在临床诊断和大规模筛查中的应用。

3、另一种检测方法是基于elisa技术的hpgv抗体检测，该方法通过固相抗原吸附剂捕获血清中的hpgv抗体进行判读。但是由于缺乏统一检测标准，不同检测体系造成了结果差异较大，无法进行横向比较，病毒拷贝数的阈值无法达成共识，给报告解读带来一定困扰。此外，elisa方法仅适用于检测hpgv抗体，无法直接检测病毒rna，因此在病毒血症期或早期感染阶段可能无法准确判断感染状态。

4、基于上述描述，需要开发一种能够快速、有效且准确检测hpgv-1病毒的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，解决了背景技术中提出的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，包括以下组分：反应液、样本处理液、hpgv-1病毒阴性对照和hpgv-1病毒阳性对照；

4、其中，反应液中包括恒温扩增体系和引物组。

5、进一步地，所述引物组为utr1引物组、utr2引物组、utr3引物组、utr4引物组和ns5引物组中的至少一种。

6、进一步地，所述utr1引物组包括序列如seq id no:1所示的f3，序列如seq id no:2所示的b3，序列如seq id no:3所示的fip，序列如seq id no:4所示的bip，序列如seq idno:5所示的lb；

7、utr2引物组包括序列如seq id no:6所示的f3，序列如seq id no:7所示的b3，序列如seq id no:8所示的fip，序列如seq id no:9所示的bip，序列如seq id no:10所示的lf，序列如seq id no:11所示的lb；

8、utr3引物组包括序列如seq id no:12所示的f3，序列如seq id no:13所示的b3，序列如seq id no:14所示的fip，序列如seq id no:15所示的bip，序列如seq id no:16所示的lf，序列如seq id no:17所示的lb；

9、utr4引物组包括序列如seq id no:18所示的f3，序列如seq id no:19所示的b3，序列如seq id no:20所示的fip，序列如seq id no:21所示的bip，序列如seq id no:22所示的lf，序列如seq id no:23所示的lb；

10、ns5引物组包括序列如seq id no:24所示的f3，序列如seq id no:25所示的b3，序列如seq id no:26所示的fip，序列如seq id no:27所示的bip，序列如seq id no:28所示的lf，序列如seq id no:29所示的lb。

11、其中，utr1引物组、utr2引物组、utr3引物组、utr4引物组和ns5引物组中各引物序列由下表1所示：

12、表1

13、

14、

15、进一步地，所述utr1引物组、utr2引物组、utr3引物组、utr4引物组和ns5引物组中的lf或lb序列，其5’端修饰有荧光淬灭基团，3’端修饰有荧光报告基团。

16、进一步地，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、vic荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-x-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种。

17、进一步地，所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3中的至少一种。

18、进一步地，所述恒温扩增体系包括10×恒温扩增缓冲液、dna聚合酶、mgcl2、dntp、无核酸酶水。

19、进一步地，所述dna聚合酶为bst聚合酶。

20、进一步地，其使用方法具体包括以下步骤：

21、s1、采集待检测的样本；

22、s2、将采集的样本加入样本处理液中，提取病毒核酸；

23、s3、将提取的病毒核酸加入用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒中，置于恒温器中，在恒定温度下进行lamp扩增；

24、s4、扩增结束后，检测扩增产物，判断样本中是否存在hpgv-1病毒。

25、进一步地，s3步骤中，lamp扩增反应温度为50-65℃，反应时间为10-60分钟。

26、本发明的有益效果：

27、本发明技术方案中，建立的lamp方法相对于常规的荧光定量pcr等hpgv-1病毒检测方法更快速、高效，从提取样品到结果判定可在40分钟内完成，反应结果判定方法简单。本发明技术方案中，所用引物能达到每微升1拷贝的灵敏度，10copies/反应以上浓度可稳定检出，显著高于现有技术水平；本发明的引物能特异性检测hpgv-1病毒，实现了对目标病原体的无误识别与高效检测。在严格的实验条件下，该方法展现出了对hbv（乙型肝炎病毒）、hcv（丙型肝炎病毒）、hav（甲型肝炎病毒）、hev（戊型肝炎病毒）、hiv（人类免疫缺陷病毒）以及cmv（巨细胞病毒）等多种常见病原体的完全非反应性，确保了检测结果的纯净与准确性，有效避免了因交叉污染或误判而导致的临床误诊风险。

技术特征：

1.一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：反应液、样本处理液、hpgv-1病毒阴性对照和hpgv-1病毒阳性对照；

2.根据权利要求1所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述引物组为utr1引物组、utr2引物组、utr3引物组、utr4引物组和ns5引物组中的至少一种。

3.根据权利要求2中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述utr1引物组包括序列如seq id no:1所示的f3，序列如seq id no:2所示的b3，序列如seqid no:3所示的fip，序列如seq id no:4所示的bip，序列如seq id no:5所示的lb；

4.根据权利要求3中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述utr1引物组、utr2引物组、utr3引物组、utr4引物组和ns5引物组中的lf或lb序列，其5’端修饰有荧光淬灭基团，3’端修饰有荧光报告基团。

5.根据权利要求4中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、vic荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-x-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5 .5中的至少一种。

6.根据权利要求4中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3中的至少一种。

7.根据权利要求1中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增体系包括10×恒温扩增缓冲液、dna聚合酶、mgcl2、dntp、无核酸酶水。

8.根据权利要求7中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述dna聚合酶为bst聚合酶。

9.根据权利要求1中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，其使用方法具体包括以下步骤：

10.根据权利要求9中所述的一种用于hpgv-1病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，s3步骤中，lamp扩增反应温度为50-65℃，反应时间为10-60分钟。

技术总结
本发明涉及一种用于HPgV‑1病毒LAMP检测的试剂盒，属于病毒检测技术领域，包括以下组分：反应液、样本处理液、HPgV‑1病毒阴性对照和HPgV‑1病毒阳性对照；其中，反应液中包括恒温扩增体系和引物组。本发明建立的LAMP方法相对于常规的荧光定量PCR等HPgV‑1病毒检测方法更快速、高效，从提取样品到结果判定可在40分钟内完成，反应结果判定方法简单且检测灵敏度高、特异性强。

技术研发人员：万振洲,赵秀丽,严蓓蓓,乔峰
受保护的技术使用者：泰州市第四人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5