一种合成绿原酸的酶产品和方法

本发明属于生物催化，涉及一种合成绿原酸的酶产品和方法，特别涉及一种以利用生物酶催化合成绿原酸的方法。

背景技术：

1、绿原酸被称为植物黄金，它有很多对人体有益的作用，如抗病毒、抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病及糖尿病等代谢性综合疾病。除在医药领域应用广泛外，还可作为饮料的防腐剂，起到杀菌作用；应用于化妆品的研发，保护肌肤减少紫外线伤害，延缓肌肤衰老；还可作为水产、家畜、家禽等动物类的天然饲料，调节动物肠道菌群，提高其自身免疫力，促进动物健康。

2、绿原酸(chlorogenic acid)是咖啡酸部分和奎宁酸部分形成的5-咖啡酰奎宁酸。绿原酸组成部分咖啡酸和奎宁酸的生成开始于莽草酸循环，从对香豆酸出发有三种绿原酸合成的典型途径。第一条路径也是最被广大学者认可的路径是咖啡酰辅酶a和奎宁酸在hqt/hct催化作用下合成绿原酸。第二条路径为c3h作用下生成绿原酸。第三条路径为以咖啡酰葡萄糖苷作为活性中间体生成绿原酸。

3、本发明根据绿原酸合成的第一条路径，克隆了绿原酸合成途径关键酶4-香豆酸-辅酶a连接酶(4cl)和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶(hqt)。4-香豆酰辅酶a连接酶(4cl)属于辅酶a连接酶家族，参与苯丙烷类物质代谢。4cl以咖啡酸为底物与辅酶a生成的咖啡酰辅酶a是绿原酸合成必要的前提物质。羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶(hqt)属于酰基转移酶家族，该酶的活性不需要任何金属，已被发现可参与金银花、甘薯、辣椒、苦荞等植物绿原酸合成。hqt是某些高等植物合成绿原酸最后一步的酶，当酰基供体为咖啡酰辅酶a时，与奎宁酸反应可生成5-咖啡酰奎宁酸即绿原酸。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是利用生物催化法将咖啡酸、辅酶a和奎宁酸转化为绿原酸。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种合成绿原酸的方法，包括以下步骤：

3、以咖啡酸、辅酶a和奎宁酸为底物，利用4-香豆酰辅酶a连接酶和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶进行催化反应，反应产物为绿原酸。

4、优选的，所述4-香豆酰辅酶a连接酶来源于：拟南芥(arabidopsis thaliana)，柳枝稷(panicum virgatum l.)，狗尾草(setaria viridis)；所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶来源于：马铃薯(solanum tuberosum l.)，潘那利番茄(solanumpennellii)，烟草(nicotiana tabacum l.)。

5、优选的，来源于拟南芥的4-香豆酰辅酶a连接酶的氨基酸序列如seq idno.2所示；

6、来源于柳枝稷的4-香豆酰辅酶a连接酶的氨基酸序列如seq id no.4所示；

7、来源于狗尾草的4-香豆酰辅酶a连接酶的氨基酸序列如seq id no.6所示；

8、来源于马铃薯的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的氨基酸序列如seq id no.8所示；

9、来源于潘那利番茄的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的氨基酸序列如seq idno.10所示；

10、来源于烟草的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的氨基酸序如seq id no.12所示。

11、优选的，在所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

12、优选的，所述4-香豆酰辅酶a连接酶或所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式加入。

13、优选的，所述咖啡酸浓度为0.1mmol/l～5mmol/l，所述辅酶a浓度为0.1mmol/l～5mmol/l，所述奎宁酸浓度为1mmol/l～10mmol/l。所述催化反应的转速为200～220rpm，所述催化反应的温度为20～35℃，所述催化反应的时间为24～48h。

14、优选的，当所述4-香豆酰辅酶a连接酶或所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时，所述4-香豆酰辅酶a连接酶在反应体系中的浓度为1g/l～5g/l；所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶在反应体系中的浓度为0.5g/l～2g/l；

15、当所述4-香豆酰辅酶a连接酶以全细胞的形式加入时，所述全细胞的湿重为10g/l～50g/l；当所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶以全细胞的形式加入时，所述全细胞的湿重为5g/l～20g/l。

16、优选的，所述催化反应在浓度为50～100mm，ph值为6.5～8.5的磷酸盐缓冲液中进行。

17、本发明提供了一种合成绿原酸的酶产品，包括4-香豆酰辅酶a连接酶和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶，或表达4-香豆酰辅酶a连接酶和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的细胞。本发明还提供了一种合成绿原酸的方法，以咖啡酸与辅酶a为底物，利用4-香豆酰辅酶a连接酶生成咖啡酰辅酶a，再以咖啡酰辅酶a和奎宁酸为底物，利用羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶催化反应生成5-咖啡酰奎宁酸即绿原酸。本发明所述方法合成效率高。

技术特征：

1.一种合成绿原酸的酶产品，其特征在于，包括4-香豆酰辅酶a连接酶和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶，或表达4-香豆酰辅酶a连接酶和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的细胞。

2.根据权利要求1所述酶产品，其特征在于，所述4-香豆酰辅酶a连接酶来源于：拟南芥(arabidopsis thaliana)、柳枝稷(panicum virgatum l.)或狗尾草(setaria viridis)；

3.根据权利要求2所述酶产品，其特征在于，来源于拟南芥的4-香豆酰辅酶a连接酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；

4.根据权利要求1所述酶产品，其特征在于，所述细胞中表达的酶包括在4-香豆酰辅酶a连接酶和羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

5.一种合成绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，包括以咖啡酸与辅酶a为底物，利用4-香豆酰辅酶a连接酶生成咖啡酰辅酶a，再以咖啡酰辅酶a和奎宁酸为底物，利用羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶催化反应生成5-咖啡酰奎宁酸即绿原酸。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述酶产品的加入形式包括粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞。

8.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述催化反应的催化体系中，咖啡酸浓度为0.1mmol/l～5mmol/l，所述辅酶a浓度为0.1mmol/l～5mmol/l，所述奎宁酸浓度为1mmol/l～10mmol/l。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当所述4-香豆酰辅酶a连接酶或所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时，所述4-香豆酰辅酶a连接酶在反应体系中的浓度为1g/l～5g/l；所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶在反应体系中的浓度为0.5g/l～2g/l；

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述催化反应的转速为200～220rpm，所述催化反应的温度为20～35℃，所述催化反应的时间为24～48h。

技术总结
本发明公开了一种合成绿原酸的酶产品和方法，属于生物催化技术领域。本发明所述酶产品包括4‑香豆酰辅酶A连接酶和羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶，或表达4‑香豆酰辅酶A连接酶和羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶的细胞。本发明还提供了一种合成绿原酸的方法，包括如下步骤：以咖啡酸与辅酶A为底物，利用4‑香豆酰辅酶A连接酶生成咖啡酰辅酶A，再以咖啡酰辅酶A和奎宁酸为底物，利用羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶催化反应生成5‑咖啡酰奎宁酸即绿原酸。本发明提供了一种以咖啡酸、辅酶A和奎宁酸为原料，通过双酶催化合成绿原酸的合成方法，转化效率高。

技术研发人员：贾振华,宋聪,李冉,姜茗轩
受保护的技术使用者：河北省科学院生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5