一种快速检测鸽微RNA病毒的可视化RT-LAMP方法

本发明涉及禽病学检测，更具体的说是涉及一种快速检测鸽微rna病毒的可视化rt-lamp方法。

背景技术：

1、随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，肉鸽饲养种群数量逐年增加，由于农产品市场贸易频繁以及生产上生物安全意识的薄弱，导致鸽群发病因素越来越多，尤其是鸽病毒性传染病，同时还常常引起沙门氏菌、大肠杆菌等细菌病的继发感染，使得鸽群的死亡率增加，给养鸽业带来了严重的经济损失。

2、2013年，phan等人报道从中国香港和匈牙利采集的51只野鸽(columba livia)粪便中首次鉴定了鸽微rna病毒(pigeonmegrivirus,pimev)，但未见进一步研究报道。国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy ofviruses,ictv)根据pimev基因特点将其划入picornaviridae科、megrivirus属的成员。picornaviridae科是一类无囊膜、单股正链rna病毒，病毒粒子由一个二十面体对称衣壳组成，包含一个非节段、高度多样化的基因组rna，大小6.7kb～10.1kb。主要通过粪-口途径或呼吸道传播病原体，感染宿主广泛，主要为哺乳动物和鸟类，能够引起胃肠道、呼吸系统、神经系统、循环系统等疾病，以及对肝细胞造成损伤。迄今为止，pimev对鸽的致病机理尚不清楚，原因是目前无法找到体外分离和培养该病毒的方法。有研究人员尝试通过spf鸡胚分离pimev，同样无法分离到该病毒，给该病的诊断和防控带来极大困难和挑战。目前pimev的诊断方法只有分子生物学检测手段，包括实时荧光定量rt-pcr、taqman实时pcr。虽然这两种方法检测pimev具有高的灵敏度和特异性，但需要专业的操作人员以及昂贵的热循仪设备和场地，使其难以作为基层实验室的推广使用。

3、因此建立一种操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、低成本的检测方法对pimev的流行病学调查和防控具有非常重要的现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种快速检测鸽微rna病毒的可视化反转录-环介导等温扩增(rt-lamp)方法。该方法可简单、快速、特异、高度灵敏的检测鸽微rna病毒，不依赖专业的检测设备和技术人员，使基层实验室能及早发现鸽微rna病毒的传播。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种检测鸽微rna病毒的引物组，所述引物组包括外引物、内引物和环状引物，所述外引物核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示，所述内引物核苷酸序列如seq idno.9和seq id no.10所示，所述环状引物核苷酸序列如seq id no.11和seq id no.12所示。

4、本发明的另一目的是，提供一种检测鸽微rna病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

5、优选的，所述引物组中外引物、内引物和环状引物的浓度比为1:7:2，其中所述外引物的浓度为2μm。

6、更优选的，所述试剂盒还包括bst 4.0dna/rna polymerase(8u/μl)、mg2+(100mm)、dntp mixture(10mm)、10×isothermo buffer(mg2+free)、dnase-free ddh2o和hnb指示剂(10×)。

7、本发明的另一目的是，提供上述引物组或上述试剂盒在制备检测鸽微rna病毒产品中的应用。

8、本发明的另一目的是，提供一种检测鸽微rna病毒的方法，包括用上述引物组或者上述试剂盒对待测样本的cdna进行检测。

9、优选的，所述方法具体包括以下步骤：

10、s1：提取待测样本的cdna；

11、s2：利用权利要求1所述引物组或者权利要求2-4任一所述试剂盒对待测样本的cdna进行可视化rt-lamp扩增；

12、s3：结果判定。

13、更优选的，步骤s2所述可视化rt-lamp扩增体系为：bst 4.0dna/rna polymerase(8u/μl)，0.2μl；mg2+(100mm)，1.0μl；dntp mixture(10mm)，1.5μl；10×primers(2μm f3/b3，14μm fip/bip，4μm lf/lb)，2.5μl；10×isothermo buffer(mg2+free)，2.5μl；dnase-free ddh2o，13.8μl；dna template，1.0μl；hnb指示剂(10×)，2.5μl。

14、更优选的，步骤s2所述可视化rt-lamp扩增程序为58℃，40min。

15、本发明可视化rt-lamp检测鸽微rna病毒的方法检出率更高，且不依赖于专业的检测设备和技术人员，操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、成本低，使基层实验室能及早发现鸽微rna病毒的传播。

技术特征：

1.一种检测鸽微rna病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物、内引物和环状引物，所述外引物核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示，所述内引物核苷酸序列如seq id no.9和seq id no.10所示，所述环状引物核苷酸序列如seq id no.11和seqid no.12所示。

2.一种检测鸽微rna病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中外引物、内引物和环状引物的浓度比为1:7:2，其中所述外引物的浓度为2μm。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括bst4.0 dna/rnapolymerase(8u/μl)、mg2+(100mm)、dntp mixture(10mm)、10×isothermo buffer(mg2+free)、dnase-free ddh2o和hnb指示剂(10×)。

5.权利要求1所述引物组或权利要求2-4任一所述试剂盒在制备检测鸽微rna病毒产品中的应用。

6.一种检测鸽微rna病毒的方法，其特征在于，包括用权利要求1所述引物组或者权利要求2-4任一所述试剂盒对待测样本cdna进行检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s2所述可视化rt-lamp扩增体系为：bst 4.0dna/rna polymerase(8u/μl)，0.2μl；mg2+(100mm)，1.0μl；dntp mixture(10mm)，1.5μl；10×primers(2μm f3/b3，14μm fip/bip，4μm lf/lb)，2.5μl；10×isothermobuffer(mg2+free)，2.5μl；dnase-free ddh2o，13.8μl；dna template，1.0μl；hnb指示剂(10×)，2.5μl。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s2所述可视化rt-lamp扩增程序为58℃，40min。

技术总结
本发明公开了一种快速检测鸽微RNA病毒的可视化RT‑LAMP方法，涉及禽病学检测技术领域。所述检测方法包括利用核苷酸序列如SEQ ID NO.7‑12所示的引物组扩增待测样本，反应结束后通过肉眼观察样品管中反应液的颜色变化对检测结果进行判定。本发明可视化RT‑LAMP检测鸽微RNA病毒的方法检出率更高，且不依赖于专业的检测设备和技术人员，操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、成本低，使基层实验室能及早发现鸽微RNA病毒的传播。

技术研发人员：韦天超,黄振兴,陈建丹,王鹏,磨美兰,黄鉴妮,黄腾
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5