一种蜡样芽孢杆菌ZW21、发酵液及制备方法和应用

本发明涉及生防菌剂领域，特别涉及一种蜡样芽孢杆菌zw21、发酵液及制备方法和应用。

背景技术：

1、炭疽病是十大植物真菌病害之一，可危害大多数植物的生长。柱花草(stylosanthes spp.)是世界热带地区重要的豆科牧草和绿肥资源，柱花草炭疽病的致病菌主要是胶孢炭疽菌(colletotrichum gloeosporioides)。目前，对植物炭疽病的防治，主要采用化学防治手段，常用的化学杀菌剂有多菌灵、代森锰锌、甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、咪鲜胺、苯醚甲环唑等。但是，化学药剂的长期使用会使病原菌产生抗药性，且造成环境污染，不利于农业绿色发展。生物农药对水、土和生态环境的威胁很小，符合绿色农业发展愿景，是未来农业病虫害防治的发展方向。但是，目前用于防治植物炭疽病的生物农药很少，尚无有效防治柱花草炭疽病的生物农药。

2、生防菌剂是创制生物农药的关键，高效生防菌株的获得与应用研究是发展新型生防菌剂的基础。目前获取生防菌株的主要途径有土壤、植物根际、植物根茎等，但这些获取途径存在随机性强、筛选效率低等缺点，而从种子内生菌中筛选拮抗菌株可以克服这些缺点，但尚无从柱花草种子中获得的炭疽菌生防菌剂。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出一种蜡样芽孢杆菌zw21、发酵液及制备方法和应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、针对现有技术中存在的问题，本发明利用产自海南儋州的热研2号柱花草太空诱变抗病株系2001-84种子与采自海南文昌的w2共培养靶向分离获得了内生菌蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)菌株zw21，并提出了该蜡样芽孢杆菌在抑制植物炭疽病菌生长方面的应用。其中，所述菌株zw21于2023年9月28日保藏于cctcc中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20231829。

4、本发明还提供一种蜡样芽孢杆菌zw21菌株发酵液，所述发酵液由本发明所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)zw21菌株发酵得到。

5、本发明还提供蜡样芽孢杆菌zw21发酵液的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)将蜡样芽孢杆菌zw21置于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；

7、(2)将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到蜡样芽孢杆菌zw21发酵液。

8、进一步的，所述蜡样芽孢杆菌zw21发酵液的制备方法，具体包括如下步骤：

9、(1)挑取活化好的菌株zw21的单菌落于50ml的lb液体培养基中，置于25～30℃、120～240rpm摇床中振荡培养4～96h，取对数生长期的菌体发酵液，得到种子液；

10、(2)将步骤(1)种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，装液量为50～200ml/250ml，发酵初始ph值4～10，种子液的接种量为1％～10％v/v，在10～37℃、120～240rpm摇床中振荡培养12～120h，离心，取上清液，过滤，得到蜡样芽孢杆菌zw21发酵液。

11、优选地，装液量为150～200ml/250ml，发酵初始ph值为4～5，种子液的接种量为5％～7％v/v，在20～30℃、180～200r/min摇床中振荡培养72～96h；所述离心的转速为9000～11000rpm/min，离心时间为10～20min。

12、更优选地，装液量为200ml/250ml，发酵初始ph值为4，种子液的接种量为7％v/v，发酵温度28℃、摇床振荡转速为200rpm，发酵时间为96h；所述离心的转速为10000rpm/min，离心时间为10min。

13、进一步的，步骤(2)，所述发酵培养基包括碳源2.5～10g/l、氮源5～15g/l、无机盐2.5～10g/l和无菌水；所述碳源包括酵母提取物、蔗糖、木糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、d-半乳糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和葡萄糖中的一种或多种；所述氮源包括牛肉膏、麸皮、胰蛋白胨、蛋白胨、硫酸铵、苯丙氨酸、谷氨酸、氯化铵、尿素中的一种或多种；所述无机盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钠、硫酸铜、硫酸锰、硫酸镁、氯化钙中的一种或多种。

14、优选地，所述碳源为水溶性淀粉，所述氮源为苯丙氨酸，所述无机盐为硫酸镁。

15、更优选地，所述发酵培养基培养基配方为：0.5％w/v的水溶性淀粉、1％w/v的苯丙氨酸和0.5％w/v的硫酸镁。

16、本发明所述的制备方法所得发酵液在柱花草盆栽与木瓜果体上的应用。

17、本发明所述的蜡样芽孢杆菌zw21菌株发酵液在防治植物炭疽病方面的应用。

18、进一步的，所述植物包括柱花草、橡胶、番木瓜、鱼尾葵、鸡冠刺桐、大薯。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、(1)本发明所得到的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)zw21菌株，可较好地抑制炭疽病菌生长，不仅可用于柱花草和番木瓜炭疽菌病害的防治，还对橡胶、鱼尾葵、鸡冠刺桐等炭疽菌的抑制效果显著，菌丝抑制率均达到70％以上。

21、(2)本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)zw21菌株拥有适应能力强及稳定性强的特点，在占领空间及生存竞争方面占绝对优势，有防治植物病虫害的活性，同时具有对人畜低毒害且绿色环保的优点。

22、(3)目前获取生防菌的主要途径有土壤、植物根际、植物根茎等，但这些获取途径存在随机性强、筛选效率低等缺点，而本发明从种子内生菌中分离得到蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)zw21菌株，可以克服上述缺点，且农作物种子内部存在可延续其免疫抗性的特定微生物，是分离生防菌的优良材料。

23、(4)本发明蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)zw21菌株最适培养基配方为0.5％w/v的水溶性淀粉，1％w/v的苯丙氨酸，0.5％w/v的硫酸镁；最适发酵初始ph值为4、温度为28℃、装液量为200ml、接种量为7％v/v、发酵时间为96h。经此条件发酵测得其无菌发酵液对柱花草胶孢炭疽菌的平板抑菌率达73.18％，与原始条件相比大约提高11倍。经此条件发酵测得其发酵液对柱花草盆栽实验的防治效果为62.5％，高于原始发酵液的防治效果(12.5％)。对番木瓜果体的防治效果为66.67％。

技术特征：

1.一种蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)zw21菌株，所述菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m20231829。

2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述zw21菌株的提取方法：利用柱花草抗病株系种子与柱花草炭疽病菌w2共培养靶向分离而获得。

3.一种蜡样芽孢杆菌zw21菌株发酵液，其特征在于，所述发酵液由权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)zw21菌株发酵得到。

4.权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌zw21发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将蜡样芽孢杆菌zw21置于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌zw21发酵液的制备方法具体包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)，装液量为150～200ml/250ml，发酵初始ph值为4～5，种子液的接种量为5％～7％v/v，在20～30℃、180～200r/min摇床中振荡培养72～96h；所述离心的转速为9000～11000rpm/min，离心时间为10～20min。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)，所述发酵培养基包括碳源2.5～10g/l、氮源5～15g/l、无机盐2.5～10g/l和无菌水。

8.权利要求4-7任一项所述的制备方法所得发酵液在柱花草盆栽与木瓜果体上的应用。

9.权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌zw21菌株发酵液在防治植物炭疽病方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括柱花草、橡胶、番木瓜、鱼尾葵、鸡冠刺桐、大薯。

技术总结
本发明提供一种蜡样芽孢杆菌ZW21、发酵液及制备方法和应用。本发明利用产自海南儋州的热研2号柱花草太空诱变抗病株系2001‑84种子与采自海南文昌的W2共培养靶向分离获得了内生菌蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株ZW21，并提出了该蜡样芽孢杆菌在抑制植物炭疽病菌生长方面的应用。其中，所述菌株ZW21于2023年9月28日保藏于CCTCC中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231829。本发明所得到的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZW21菌株，可较好地抑制炭疽病菌生长，不仅可用于柱花草和番木瓜炭疽病菌病害的防治，还对橡胶、鱼尾葵、鸡冠刺桐等炭疽菌的抑制效果显著，菌丝抑制率均达到70％以上。

技术研发人员：蒋凌雁,张吉昌,许云凤,罗丽娟
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5