一种高效水解柑橘皮的方法
本发明属于生物质精炼领域，具体涉及对柑橘皮原料的处理，酶水解过程中纤维素酶、辅酶和添加剂用量的确定，以及使用响应面法优化纤维素酶混合物。
背景技术：
1、柑橘类水果的消费和工业过程产生了大量的废物，果皮作为主要残留物，约占其重量的一半。目前，这些废弃物中大多数没有得到合理处置，只是用于作为动物饲料消耗或倾倒在垃圾填埋场，对土地、土壤、地下水可能造成污染，也给固体废弃物管理带来了巨大挑战。近年来，出于环境和经济两方面的考虑，许多研究人员一直在进行广泛的研究，以开发从柑橘废弃物中生产各种重要化学物质的新技术，提高其应用价值。事实上，柑橘皮中含有较高的碳水化合物，以可溶性碳水化合物(葡萄糖、果糖、蔗糖)和不可溶性碳水化合物(果胶、纤维素、半纤维素)的形式存在。柑橘皮中的可溶性碳水化合物和不可溶性碳水化合物均有望成为制备可发酵糖，是转化为生物燃料乙醇及高附加值化工产品的重要原料。
2、作为生产燃料乙醇或其他化学品的基础，木质纤维素生产可发酵糖需通过纤维素酶解实现。纤维素酶解技术的主要障碍是纤维素酶生产成本过高，已成为制约生物基化学品和材料发展的关键因素，因此，提高酶解效率、降低酶的用量成为促进纤维素生物质高效转化的重要途径。基于复杂底物与其专一性水解纤维素酶的适配性原理，一种纤维素酶并不适用于不同底物，即高效的纤维素酶需要根据水解底物量身定制。
技术实现思路
1、综上所述，本发明提供一种对纤维素酶添加辅酶和添加剂进行复配定制的思路和方法，通过根据特定底物复配纤维素酶，开发成本效益高的酶解工艺。此外，由于柑橘皮酶水解产生的可发酵糖以葡萄糖为主，所以本v发明仅以葡萄糖产量为例说明酶解效率。
2、本发明提供一种利用复配定制纤维素酶高效水解柑橘皮的方法，旨在降低原料的预处理和纤维素酶成本，最大限度地提高柑橘皮废物的酶解效率，为木质纤维素生物质的高效生物炼制提供创新方法。
3、本发明首先提供一种高效水解柑橘皮的方法，其包括如下步骤：
4、(1)柑橘皮原料前处理：筛选出选无病斑、无虫蛀、无霉变、无破损的柑橘皮，切成块状，干燥使水分含量低于10％；使用高速均质机打磨得到柑橘粉末；任选地，在室温下贮存于密封袋中备用；
5、(2)在柠檬酸缓冲液使体系中溶解所述柑橘粉末，然后添加纤维素酶、辅酶、添加剂，构成酶解体系；所述辅酶为β-葡萄糖苷酶或半纤维素酶；所述添加剂为槐糖脂和peg6000，或者槐糖脂和吐温80。
6、(3)在45-55℃和10-250rpm振荡速度的条件下持续酶解。
7、具体地，第(1)步中，将新鲜柑橘皮其裁剪为1-2厘米的块状；在50℃的鼓风机烤箱中干燥12小时，使水分含量低于10％。
8、优选地，所述酶解体系中柑橘粉末重量百分比为5-15％(优选为9-11％)；柠檬酸缓冲液的ph为4.5-5.5(优选为4.8)。
9、具体地，所述辅酶为β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶。
10、优选地，酶解体系中纤维素酶的用量18-22fpu/g；β-葡萄糖苷酶的用量为2.5-9.0fpu/g；半纤维素酶的用量为100-250fpu/g。
11、进一步优选地，酶解体系中纤维素酶的用量20fpu/g；β-葡萄糖苷酶的用量为5-8fpu/g；半纤维素酶的用量为180-210fpu/g。
12、另外优选地，槐糖脂的用量为40-80mg/g；peg6000的用量为15-60mg/g；吐温80的用量为40-80mg/g。
13、进一步优选地，槐糖脂的用量为45-65mg/g；peg6000的用量为18-22mg/g；吐温80的用量为45-55mg/g。
14、本发明还提供所述的方法得到的水解产物。
15、本发明是通过研究分析探索形成，主要考虑因素有：一是由于柑橘类水果的消费和工业过程产生了大量的废物，果皮作为主要残留物没有得到合理处置，只是用于作为动物饲料消耗或倾倒在垃圾填埋场，对土地、土壤、地下水可能造成污染，给固体废弃物管理带来了巨大挑战。然而，柑橘皮废物作为木质纤维素生物质，富含可溶性和不可溶性碳水化合物，在生物精炼方面具有巨大潜力，然而这些碳水化合物与果胶等各种成分通过复杂结构交联，需要考虑在尽可能少损失糖组分的前提下将其高效分离。二是在木质纤维素生物炼制工业中经常使用的预处理(如酸预处理、微波辅助预处理和爆破预处理)反应程度剧烈，不仅消耗时间和能量且使用的化学试剂会对环境产生一定污染，还会引起部分糖损失。本发明充分考虑化学预处理对于糖的降解及对后续生物转化产生的抑制物，主要考虑消除预处理环节进行可发酵糖提取。三是基于复杂底物与其专一性水解纤维素酶的适配性的原理，一种纤维素酶并不适用于所有底物，所以开发针对柑橘皮的高效专一的复合酶系对于降低柑橘皮酶解成本至关重要。因此，本发明根据柑橘皮底物筛选出了两种辅酶和两种添加剂对纤维素酶进行复配定制，通过响应面设计，确定了最佳的添加量，使得最后得到的纤维素酶混合物在效果上达到最佳。
16、最终本发明获得的优点包括：(1)将柑橘皮转化成可发酵糖，提供了一种柑橘皮高值利用的新途径，有助于提高柑橘皮废弃物的附加价值，不仅可以有效解决环境问题，还可以减少对石油资源的依赖，提高经济效率；(2)通过复配定制纤维素酶，提高纤维素酶酶解效率，减少纤维素酶用量以节约生产成本，从而促进纤维素生物转化途径工业化生产；(3)经过复配定制后的纤维素酶可达到与高剂量纤维素酶相同的效率。
技术特征：
1.一种高效水解柑橘皮的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（1）步中，将新鲜柑橘皮其裁剪为1-2厘米的块状；在50℃的鼓风机烤箱中干燥12小时，使水分含量低于10%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解体系中柑橘粉末重量百分比为5-15%（优选为9-11%）；柠檬酸缓冲液的ph为4.5-5.5（优选为4.8）。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶为β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，酶解体系中纤维素酶的用量18-22 fpu/g；β-葡萄糖苷酶的用量为2.5-9.0 fpu/g；半纤维素酶的用量为100-250 fpu/g。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，酶解体系中纤维素酶的用量20 fpu/g；β-葡萄糖苷酶的用量为5-8 fpu/g；半纤维素酶的用量为180-210 fpu/g。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，槐糖脂的用量为40-80 mg/g；peg6000的用量为15-60 mg/g；吐温80的用量为40-80 mg/g。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，槐糖脂的用量为45-65 mg/g；peg6000的用量为18-22 mg/g；吐温80的用量为45-55 mg/g。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法得到的水解产物。
技术总结
本发明公开使用复配定制纤维素酶高效水解柑橘皮的方法，步骤包括：（1）对新鲜柑橘皮进行裁剪、烘干、打磨处理，得到柑橘皮粉末；（2）通过单因素实验确定纤维素酶用量；（3）通过单因素实验确定辅酶用量；（4）通过单因素实验确定添加剂及其用量；（5）选择两种辅酶和两种添加剂，使用4因子Box‑Behnken设计（BBD）对纤维素酶进行复配定制；（6）根据BBD拟合模型确定纤维素酶混合物的配比，柑橘皮水解72 h后，葡萄糖浓度可以提高约36.74%。本发明通过对纤维素酶进行复配定制，改善了纤维素酶对底物的适配性，从而提高了柑橘皮酶解后的葡萄糖产率，解决了纤维素酶水解效率较低的问题。
技术研发人员：李婧,杨玮晴,姚志良
受保护的技术使用者：北京工商大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5