高保真度限制性内切核酸酶的制作方法
背景技术：
1、限制性内切核酸酶是以序列特异性方式切割双链dna的酶(roberts,r.j.,procnatl acad sci u s a,102:5905-5908(2005)；roberts,et al.,nucleic acids res,31:1805-1812(2003)；roberts,et al.,nucleic acids res,33:d230-232(2005)；alves,etal.,restriction endonucleases,“protein engineering of restriction enzymes,”ed.pingoud,springer-verlag berlin heidelberg,new york,393-407(2004))。它们在原核生物中是普遍存在的(raleigh,et al.,bacterial genomes physicalstructureand analysis,ch.8,eds.de bruijin,et al.,chapman&hall,new york,78-92(1998))，其中它们形成限制修饰系统的一部分，其主要由内切核酸酶和甲基转移酶构成。同源的(cognate)甲基转移酶甲基化与其配对内切核酸酶识别的序列相同的特异性序列，并赋予被修饰dna对内切核酸酶切割的抗性，以便宿主dna可以被恰当地保护。然而，当存在外源dna侵入时，特别是噬菌体dna侵入时，外源dna将在其可被完全甲基化之前降解。限制修饰系统的主要生物功能是保护宿主免于噬菌体感染(arber,science,205:361-365(1979))。其他的功能也已被提出，例如涉及重组和转座(carlson,et al.,mol microbiol,27:671-676(1998)；heitman,genet eng(n y),15:57-108(1993)；mckane,et al.,genetics,139:35-43(1995))。
2、大约3,000种已知的限制性内切核酸酶对它们的超过250种不同靶序列的特异性可以被考虑为它们最令人感兴趣的特性。在发现第一种限制性内切核酸酶的序列特异性性质(danna,et al.,proc natl acad sci u s a,68:2913-2917(1971)；kelly,etal.,j molbiol,51:393-409(1970))之后，科学家们没有花费太长时间发现了某些限制性内切核酸酶在非最适条件下切割与其限定识别序列相似但不相同的序列(polisky,et al.,proc natlacad sci u s a,72:3310-3314(1975)；nasri,et al.,nucleic acids res,14:811-821(1986))。该松弛的特异性(relaxed specificity)被称为限制性内切核酸酶的星号活性(star activity)。已提出，限制性内切核酸酶和dna之间水介导的相互作用是特异性复合物和星复合物(star complexes)之间的主要差异(robinson,et al.,j mol biol,234:302-306(1993)；robinson,et al.,proc natl acad sci u s a,92:3444-3448(1995),sidorova,et al.,biophys j,87:2564-2576(2004))。
3、星号活性是分子生物学反应中的问题。星号活性在克隆载体或其他dna中引入不希望的切割。在例如法医应用的情况中，在这种情况下某些dna底物需要被限制性内切核酸酶切割以产生独特的指纹图谱，星号活性将改变切割图案特性，从而使分析复杂化。避免星号活性在例如链置换扩增技术(walker,et al.,proc natl acad sci u s a,89:392-396(1992))和基因表达的系列分析(velculescu,et al.,science,270:484-487(1995))的应用中也是关键的。
技术实现思路
0、发明概述
1、在本发明的一个实施方式中，提供组合物，所述组合物包含具有至少一个人工引入突变和至少2的总保真度指数(fi)改进因子(overall fidelity index improvementfactor)的限制性内切核酸酶，在预定的缓冲液中所述限制性内切核酸酶能以与不存在所述人工引入突变的限制性内切核酸酶的切割活性至少相似的切割活性切割底物，所述人工引入突变是靶向突变、饱和诱变或通过pcr扩增过程引入的突变的至少一个的产物。
2、在本发明的进一步的实施方式中，人工引入突变中的至少一个是靶向突变，其是由用带相反电荷的残基置换天然存在的残基产生的。丙氨酸或苯丙氨酸可以置换靶位点处的天然存在的残基。
3、在本发明的进一步的实施方式中，上面描述类型的组合物包括选自下列的不存在人工引入突变的限制酶：bamhi、ecori、scai、sali、sphi、psti、ncoi、nhei、sspi、noti、saci、pvuii、mfei、hindiii、sbfi、eagi、ecorv、avrii、bstxi、pcii、hpai、agei、bsmbi、bspqi、sapi、kpni和bsai。
4、本发明进一步的实施方式包括在表4中列出的组分。
5、在本发明的进一步的实施方式中，提供编码在表4中列出的酶的任一种的dna，包含该dna的载体和从该载体表达蛋白质的宿主细胞。
6、在本发明的一个实施方式中，提供具有下列步骤的方法：(a)鉴定在具有星号活性的限制性内切核酸酶的氨基酸序列中，哪些氨基酸残基是带电荷的氨基酸；(b)在编码该限制性内切核酸酶的基因序列中，突变编码一个或更多个带电荷的残基的一个或更多个密码子；(c)产生在不同的带电荷的残基具有一个或更多个不同密码子突变的基因序列文库；(d)获得突变的基因序列表达的蛋白质组(a set of proteins)；和(e)测定每一表达蛋白质在预定缓冲液中的fi和切割活性。
7、该方法的一个实施方式包括在限定的缓冲液组中对属于该蛋白质组的蛋白质测定总fi改进因子的步骤，其中例如，缓冲液组包含neb1、neb2、neb3和neb4缓冲液。
8、该方法的一个实施方式包括上面描述的步骤和另外地，在突变带电荷的氨基酸的密码子的同一步骤或随后步骤中，突变编码羟化氨基酸或酰胺氨基酸的密码子。
9、在上面描述的本发明的一个实施方式中，将除了酪氨酸以外的密码子突变为丙氨酸，将酪氨酸突变为苯丙氨酸。
10、在一个进一步的实施方式中，使用对一个或更多个突变密码子的饱和诱变，改进总fi改进因子。
技术特征：
1.组合物，其包括：具有至少一个人工引入突变和至少2的总保真度指数(fi)改进因子的限制性内切核酸酶，在预定的缓冲液中，所述限制性内切核酸酶能够以与不存在所述人工引入突变的限制性内切核酸酶的切割活性至少相似的切割活性切割底物，其中所述人工引入突变是靶向突变、饱和诱变或通过pcr扩增过程引入的突变的至少一个的产物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个所述人工引入突变是在所述限制性内切核酸酶的靶位点处，用带相反电荷的残基置换天然存在的残基。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个所述人工引入突变是在所述限制性内切核酸酶的靶位点处，用选自苯丙氨酸和丙氨酸的残基置换天然存在的残基。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶选自bamhi、ecori、scai、sali、sphi、psti、ncoi、nhei、sspi、noti、saci、pvuii、mfei、hindiii、sbfi、eagi、ecorv、avrii、bstxi、pcii、hpai、agei、bsmbi、bspqi、sapi、kpni和bsai。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶是bamhi，并且所述人工引入突变选自：e163a/e167t；k30a；e86a；e86p；k87a；k87e；k87v；k87n；p144a；y165f；e167a；e167r；e167k；e167l；e167i；k30a/e86a；e86a/k106a；k30a/e86a/k106a；k30a/k87a；e86p/k87e；e86a/y165f；k30a/e167a；e163s/e170t/p173a；e163s/e170t/p173a；e86p/k87t/k88n/e163s/e170t/p173a；e86p/k87r/k88g/e163s/e170t/p173a；e86p/k87p/k88r/e163s/e170t/p173a/e211k；e86p/k87t/k88r/e163s/e170t/p173a/n158s；e86p/k87s/k88p/e163s/e170t/p173a；e86p/k87g/k88s/e163s/e170t/p173a；e86p/k87r/k88q/e163s/e170t/p173a；和e86p/k87w/k88v；和e86p/p173a。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶是ecori，并且所述人工引入突变选自：k62a；k62s；k62l；r9a；k15a；r123a；k130a；r131a；r183a；s2y；d135a；r187a；和k62e。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶是scai，并且所述人工引入突变选自r18a；r112a；e119a；h193a；s201f；和h193a/s201f。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶是sali，并且所述人工引入突变选自r82a；k93a；k101a；和r107a。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶是sphi，并且所述人工引入突变选自d91a；d139a；d164a；和k100a。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶是psti，并且所述人工引入突变选自e204g；k228a；k228a/a289v；和d91a。
技术总结
本发明的发明名称为高保真度限制性内切核酸酶。本申请提供针对具有改变性质的酶的组合物和方法，其包括诱变的系统方法和允许选择希望的蛋白质的筛查分析。该方法的实施方式特别适于改变限制性内切核酸酶的特定性质如星号活性。该组合物包括具有减少星号活性的限制性内切核酸酶，如通过总保真度指数改进因子限定的。
技术研发人员：朱振宇,A·布兰查德,徐双勇,管胜昔,魏华,张鹏华,孙大鹏,陈少康
受保护的技术使用者：新英格兰生物实验室公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5