基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物及构建方法与流程

本发明涉及类器官培养领域，具体涉及基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，还涉及利用组合物构建类器官的方法。

背景技术：

1、类器官是一种3d细胞培养模型，因其3d结构更接近人类生物自2009年被hansclevers等创建该技术以来，随着科学家们对类器官技术的不断深耕，3d类器官模型技术与2d细胞培养技术相比，可以更进一步实现成功率更高的从肿瘤组织个性化的模型，从而实现个性化用药方案的筛选。

2、卵巢癌是女性第八大致死癌症，在我国，卵巢癌(ovarian cancer，oc)年发病率居女性生殖系统肿瘤第3位，位于子宫颈癌和子宫体恶性肿瘤之后，呈逐年上升的趋势，而病死率位于女性生殖道恶性肿瘤之首，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，且恶性程度高，易发生转移。目前，70％上皮性卵巢癌患者在初始治疗后的三年内复发。复发次数增多、间隔时间逐渐缩短，导致患者随之从化疗敏感变至耐药最终导致治疗失败。卵巢恶性肿瘤包括多种病理类型，其中最常见的是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，eoc)，约占卵巢恶性肿瘤的80％，其次是恶性生殖细胞肿瘤和性索间质肿瘤，各约占10％和5％。

3、不同组织学类型的卵巢癌表现出不同类型的代谢变化，包括化学耐药、化学敏感、强侵袭性和弱侵袭性细胞，所以确认患者病理分型对临床用药具有重要意义，获取活检标本是确认病例分型的有效途径。获取活检标本的途径有腹腔镜手术、开腹手术、超声引导下穿刺活检(core-needle biopsy，cnb)等。腹腔镜手术和开腹手术需要全身麻醉，且创伤大。超声引导下的超声引导下穿刺活检是目前临床应用最为普及与实用的组织取材方法，其可及性与可操作性好、风险与创伤小、对患者的一般情况要求相对低，临床应用日渐广泛，但是穿刺得到的肿瘤样本远低于腹腔镜手术与开腹手术。

4、目前，针对组织量大的卵巢癌类器官的构建技术相对成熟，多由各种类型胶原酶解离组织得到卵巢癌原代细胞，然而由于穿刺样本较小，胶原酶在酶解时酶解反应剧烈，对细胞放入损伤较大，易产生大量死细胞，因此胶原酶在处理穿刺样本时，会损失大量原代细胞，影响后续类器官的产量。基于此，建立一种卵巢癌穿刺样本的类器官构建方法，尤为重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物；本发明的目的之二在于提供利用所述的组合物构建类器官的方法。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，所述组合物包括样本保存液和样本培养基；

4、所述样本保存液各组分如下：在1-20μm necrostatin-1，15-40mm glutamax，0.5-3％青霉素-链霉素-两性霉素b，余量为advanced dmem/f12；

5、所述样本培养基各组分如下：0.5-3mm sodium pyruvate，10-50mm hepes，10-50mm glutamax，100-300μg/ml primocin，10-200nm 17-βestradiol，200-1000ng/mlhydrocortisone，1-10μm a83-01，1-10μm nicotinamide，5-30ml/l n-2supplement，5-30ml/l b-27supplement，1-3mm n-acetylcysteine，0.1-2μm adezmapimod，5-100ng/mlegf，10-200ng/ml fgf-10，50-200ng/ml noggin，50-250ng/ml r-spondin1，20-200ng/mlheregulin-β-1，50-500ng/ml wnt3a，2-20μm forskolin，5-20μm y-27632，0.5-3％青霉素-链霉素-两性霉素b，余量为advaced dmem/f12。

6、本发明优选的，还包括样本清洗液，所述清洗液各组分浓度如下：0.5-3％青霉素-链霉素-两性霉素b，0.05-0.5mg/ml dnaseⅰ，1-5mg/ml dispase ii，5-20μm y-27632，余量为1×dpbs。

7、本发明优选的，所述样本保存液各组分如下：1-20μm necrostatin-1，15-40mmglutamax，0.5-3％青霉素-链霉素-两性霉素b，余量为advanced dmem/f12。

8、本发明优选的，所述样本培养基各组分如下：1mm sodium pyruvate，10-25mmhepes，20-30mm glutamax，100-200μg/ml primocin，10-20nm 17-βestradiol，500ng/mlhydrocortisone，3-5μm a83-01，5μm nicotinamide，10ml/l n-2supplement，20ml/l b-27supplement，1.25mm n-acetylcysteine，0.5-1μm adezmapimod，20ng/ml egf，100～200ng/ml fgf-10，100-200ng/ml noggin，50-250ng/ml r-spondin1，50ng/ml heregulin-β-1，100ng/ml wnt3a，5-10μm forskolin，10μm y-27632，1％青霉素-链霉素-两性霉素b，余量为advaced dmem/f12。

9、2、利用所述的组合物构建类器官的方法，具体方法如下：

10、(1)取卵巢癌穿刺活检样本离体后，用清洗液清洗样本后，用保存液保存；

11、(2)将保存样本用台盼蓝染色液染色，切除已被染色的非活细胞组织，未被染色的穿刺样本转移样本清洗液中，摇晃清洗，期间更换清洗液，同时收集清洗液；

12、(3)将收集的清洗液进行离心，收集管底沉淀；

13、(4)清洗结束，离心收集疏松柔软的肿瘤样本，与步骤(3)得到的沉淀过100μm滤网；

14、(5)离心弃去上清，收集样本沉淀，加入所述样本培养基，形成细胞悬液后与matrigel充分混匀，滴入孔板；静置培养让基质胶充分凝固，然后再加入所述样本培养基培养24h后，然后加入不含y-27632的样本培养基，每3天换液一次，培养至卵巢癌类器官形成。

15、本发明优选的，步骤(1)为穿刺活检样本离体后，使用5倍样本体积的清洗液清洗样本，随之转移至10倍样本体积的样本保存液中，0-8℃冷链运输。

16、本发明优选的，步骤(2)中，所述台盼蓝染色液的浓度为0.4％，染色时间为1min。

17、本发明优选的，步骤(2)中，所述摇晃清洗为25℃，200rpm，60-90min，每5min更换一次样本清洗液。

18、本发明优选的，步骤(4)和步骤(5)中，所述离心为500×g，4℃，10min。

19、本发明的有益效果在于：本发明提供了基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，该组合物配方合理，能够快速高效的从卵巢癌穿刺样本中构建得到大量卵巢癌类器官，且无需单独消化酶解，避免了胶原酶在酶解时酶解反应剧烈，对细胞放入损伤较大，易产生大量死细胞，影响后续类器官的产量的问题，与传统类器官构建技术相比，提高了卵巢癌穿刺样本类器官的构建效率与数量。

技术特征：

1.基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，其特征在于：所述组合物包括样本保存液和样本培养基；

2.根据权利要求1所述基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，其特征在于：还包括样本清洗液，所述清洗液各组分浓度如下：0.5-3％青霉素-链霉素-两性霉素b，0.05-0.5mg/ml dnaseⅰ，1-5mg/ml dispase ii，5-20μm y-27632，余量为1×dpbs。

3.根据权利要求1所述基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，其特征在于：所述样本保存液各组分如下：1-20μm necrostatin-1，15-40mm glutamax，0.5-3％青霉素-链霉素-两性霉素b，余量为advanced dmem/f12。

4.根据权利要求1所述基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物，其特征在于：所述样本培养基各组分如下：1mm sodium pyruvate，10-25mm hepes，20-30mm glutamax，100-200μg/ml primocin，10-20nm 17-βestradiol，500ng/ml hydrocortisone，3-5μma83-01，5μm nicotinamide，10ml/l n-2supplement，20ml/l b-27supplement，1.25mm n-acetylcysteine，0.5-1μm adezmapimod，20ng/ml egf，100～200ng/ml fgf-10，100-200ng/ml noggin，50～250ng/ml r-spondin1，50ng/ml heregulin-β-1，100ng/ml wnt3a，5-10μmforskolin，10μm y-27632，1％青霉素-链霉素-两性霉素b，余量为advaced dmem/f12。

5.利用权利要求1～4任一项所述的组合物构建类器官的方法，其特征在于,具体方法如下：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)为穿刺活检样本离体后，使用5倍样本体积的清洗液清洗样本，随之转移至10倍样本体积的样本保存液中，0-8℃冷链运输。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述台盼蓝染色液的浓度为0.4％，染色时间为1min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述摇晃清洗为25℃，200rpm，60-90min，每5min更换一次样本清洗液。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(4)和步骤(5)中，所述离心为500×g，4℃，10min。

技术总结
本发明公开了基于卵巢癌临床穿刺样本构建类器官的组合物及构建方法，组合物包括样本保存液和样本培养基；配方合理，能够快速高效的从卵巢癌穿刺样本中构建得到大量卵巢癌类器官，且无需单独消化酶解，与传统类器官构建技术相比，提高了卵巢癌穿刺样本类器官的构建效率与数量。

技术研发人员：刘海洋,于升,苏芮,阚方明,米小容,何晓燕,黄璘
受保护的技术使用者：北京嘉士腾医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5