偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用。
背景技术：
1、依托泊苷是应用于临床治疗肿瘤的广谱抗癌药。由于其水溶性差，目前临床上使用的依托泊苷制剂多以聚山梨酯-80，聚乙二醇-400，苯甲醇，枸橼酸和无水乙醇混合液作为助溶剂。给药前用生理盐水或者葡萄糖稀释到终浓度。这些助溶剂可导致多种不良反应，比较明确的包括过敏反应和神经毒性。
2、为了解决依托泊苷水溶性差和临床制剂的毒副作用，现在普遍认为纳米粒子作为药物载体具有潜在的应用前景，纳米颗粒或者纳米纤维作为药物传输体系可以延长药物作用时间增强药效，减轻毒副作用控制药物释放、提高难溶药物的溶解性，而且可以通过对纳米颗粒或者纳米纤维的修饰，比如连上靶向性的基团，如叶酸、转铁蛋白等，提高载体或者纳米药物粒子的靶向性，从而避免药物在非特异性的组织释放。小分子自组装形成的纳米粒子或者纳米纤维在近几年得到广泛的关注，尤其是小分子多肽类的自组装,因为其具有生物相容性好，对身体无毒,容易合成等优点。小分子水凝胶作为一种新型的材料，由于其良好的生物相容性，较好的三维形貌，已经在生物医学和生物材料方面得到国内外科学家广泛的研究。
3、迄今为止，我们已经设计出了羧酸酯酶介导的依托泊苷纳米纤维的释放系统。但是，由于羧酸酯酶在各种细胞中均有表达，并不能特异性的在肿瘤组织中释放依托泊苷，因此我们重新设计出了在缺氧微环境中偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装体系，可以在肿瘤缺氧组织中特异性释放出依托泊苷，用以增强依托泊苷对肿瘤的治疗效果。
技术实现思路
1、有鉴于此，为解决上述技术问题，本发明提出了一种偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽，并提出了其制备方法和应用，通过自组装短肽nap-gffpye(azo)-n3与疏水性药物依托泊苷连接起来形成nap-gffpye(azo)-etoposide的小分子多肽化合物，通过碱性磷酸酶催化自组装形成纳米纤维，该纳米纤维可以内吞的形式进入细胞内，并在缺氧的肿瘤细胞中偶氮还原酶的作用下释放出游离的依托泊苷原药，显著提高依托泊苷在缺氧肿瘤细胞中的浓度，增强依托泊苷对肿瘤的治疗效果。
2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
3、一种偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽，所述多肽为nap-gffpye(azo)-etoposide，包括nap-gffpye(azo)-etoposide1,nap-gffpye(azo)-etoposide2和nap-gffpye(azo)-etoposide3；
4、所述nap-gffpye(azo)-etoposide1的结构式为：
5、
6、所述nap-gffpye(azo)-etoposide2的结构式为：
7、
8、所述nap-gffpye(azo)-etoposide3的结构式为：
9、
10、在本发明的一些优选的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽的实施方式中，所述nap-gffpye(azo)-etoposide为由nap-gffpye(azo)-n3和依托泊苷炔基衍生物经click反应得到；
11、nap-gffpye(azo)-etoposide中的-etoposide1、-etoposide2、-etoposide3三种依托泊苷炔基衍生物的结构式分别为：
12、
13、所述多肽nap-gffpye(azo)-etoposide的n端为具有酶促自组装性质的短肽nap-gffpye(azo)-n3，短肽结构中的叠氮基团与依托泊苷衍生物中的炔基在一价铜离子的催化下发生点击化学反应，形成一个整体分子，即自组装的短肽nap-gffpye(azo)-n3与依托泊苷的链接方式是在偶氮还原酶作用下可以裂解的偶氮键。
14、本发明第二方面提出了所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽的制备方法，包括如下步骤：
15、s1、中间体化合物fmoc-py-cooh的合成：
16、1)取五氧化二磷、磷酸、酪氨酸反应；反应后加入水，用正丁醇稀释，低温下有白色固体析出，过滤、沉淀、洗涤、干燥后，得到磷酸化的酪氨酸；
17、2)把磷酸化的酪氨酸溶于饱和的碳酸氢钠溶液中，加入溶剂溶解的fmoc-osu进行反应，除去溶剂，加入盐酸，乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，加无水硫酸钠干燥，除去乙酸乙酯，得到fmoc-磷酸化酪氨酸；
18、s2、nap-gffpye(azo)-n3的固相合成：
19、1)在固相合成器中将fmoc-glu(n3)-cooh连接在固相载体2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行反应；
20、2)用哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液去除保护基团fmoc，取多肽缩合剂hbtu放入步骤1)的固相合成器中，依次加入fmoc-py-oh、fmoc-f-oh、fmoc-f-oh，fmoc-g-oh，短肽的n端用萘乙酸封端，得到自组装短肽nap-gffpye(azo)-n3；
21、3)用切割液三氟乙酸把制备的短肽从树脂上切除，并将所得nap-gffpye(azo)-n3用高效液相色谱仪进行分离；
22、s3、nap-gffpye(azo)-etoposide 1，nap-gffpye(azo)-etoposide 2、nap-gffpye(azo)-etoposide3的合成：
23、1)将依托泊苷溶于n,n-二甲基甲酰胺溶液中，加入(e)-4-nitrophenyl(4-((4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl)diazenyl)benzyl)carbonate，纯化，得到依托泊苷的三个炔基修饰的衍生物etoposide1，etoposide2和etoposide3；
24、2)取依托泊苷的三个炔基修饰的衍生物，分别与固相合成的自组装多肽nap-gffpye(azo)-n3在一价铜离子溶液中反应，反应结束后，高效液相分离，得到偶氮还原酶响应的依托泊苷纳米纤维多肽nap-gffpye(azo)-etoposide1，nap-gffpye(azo)-etoposide2和nap-gffpye(azo)-etoposide3。
25、本发明第三方面提供了所述偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，nap-gffpye(azo)-etoposide1的小分子化合物通过在碱性磷酸酶的pbs溶液中自组装形成纳米纤维或通过在细胞膜表面高表达的碱性磷酸酶的催化下自组装形成纳米纤维。
26、nap-gffpye(azo)-etoposide2的小分子化合物通过在碱性磷酸酶的pbs溶液中自组装形成纳米纤维或通过在细胞膜表面高表达的碱性磷酸酶的催化下自组装形成纳米纤维。
27、nap-gffpye(azo)-etoposide3的小分子化合物通过在碱性磷酸酶的pbs溶液中自组装形成纳米纤维或通过在细胞膜表面高表达的碱性磷酸酶的催化下自组装形成纳米纤维。
28、在本发明的一些优选的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用的实施方式中，自组装形成纳米纤维通过内吞的方式进入细胞内。
29、需要说明的是，本发明用到的氨基酸均为l构型的纯天然氨基酸。
30、相对于现有技术，本发明所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用具有以下优势：
31、(1)本发明所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽nap-gffpye(azo)-etoposide(包括nap-gffpye(azo)-etoposide1，nap-gffpye(azo)-etoposide2、nap-gffpye(azo)-etoposide3)，采用自组装小分子多肽nap-gffpye(azo)-n3与疏水性药物依托泊苷连接形成，通过体外碱性磷酸酶或者细胞膜表面碱性磷酸酶催化下自组装形成纳米水凝胶(纳米纤维)，该纳米纤维可以内吞的形式进入细胞内，并在缺氧的肿瘤细胞中偶氮还原酶的作用下释放出游离的依托泊苷原药，显著提高依托泊苷在缺氧肿瘤细胞中的浓度，增强依托泊苷对肺癌的治疗效果；
32、(2)本发明所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽nap-gffpye(azo)-etoposide的制备过程中，采用的原料为培养细胞每天所需要的各种氨基酸，对细胞不产生毒副作用，制备得到的自组装多肽载体nap-gffpye(azo)-n3对细胞生长没有明显的抑制现象；
33、(3)本发明制备得到的纳米水凝胶具有良好的生物相容性及较好的三维形貌(10纳米左右的纳米纤维)，能更容易进入肿瘤细胞，在生物材料药物递送方面应用前景广泛。
技术特征：
1.偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽，其特征在于：所述多肽为nap-gffpye(azo)-etoposide，包括nap-gffpye(azo)-etoposide1,nap-gffpye(azo)-etoposide2和nap-gffpye(azo)-etoposide3；
2.根据权利要求1所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽，其特征在于：nap-gffpye(azo)-etoposide为由nap-gffpye(azo)-n3和依托泊苷炔基衍生物经click反应得到；
3.权利要求1或2所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.权利要求1所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，其特征在于：nap-gffpye(azo)-etoposide1的小分子化合物通过在碱性磷酸酶的pbs溶液中自组装形成纳米纤维或通过在细胞膜表面高表达的碱性磷酸酶的催化下自组装形成纳米纤维。
5.权利要求1所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，其特征在于：nap-gffpye(azo)-etoposide2的小分子化合物通过在碱性磷酸酶的pbs溶液中自组装形成纳米纤维或通过在细胞膜表面高表达的碱性磷酸酶的催化下自组装形成纳米纤维。
6.权利要求1所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，其特征在于：nap-gffpye(azo)-etoposide3的小分子化合物通过在碱性磷酸酶的pbs溶液中自组装形成纳米纤维或通过在细胞膜表面高表达的碱性磷酸酶的催化下自组装形成纳米纤维。
7.根据权利要求4、5或6所述的偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用，其特征在于：自组装形成纳米纤维通过内吞的方式进入细胞内。
技术总结
本发明提供了一种偶氮还原酶响应的依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用。通过自组装短肽Nap‑GFFpYE(Azo)‑N3的C端谷氨酸上的叠氮基团与依托泊苷衍生物上的炔基以Click反应的方式连接起来，形成偶氮还原酶响应的Nap‑GFFpYE(Azo)‑Etoposide(1/2/3)的小分子多肽化合物，通过碱性磷酸酶催化自组装形成纳米纤维，该纳米纤维可以内吞的形式进入细胞内，并在缺氧的肿瘤细胞中偶氮还原酶的作用下释放出游离的依托泊苷原药，显著提高依托泊苷在缺氧肿瘤细胞中的浓度，增强依托泊苷在缺氧微环境中的抗肿瘤活性。
技术研发人员：张智松,李鲁远,张立松,崔梦娇
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5