一种匹配时序骨再生的短纤维微球支架及制备方法与应用与流程

本发明属于生物医用材料，具体涉及一种能够匹配时序骨再生的短纤维微球支架及制备方法与应用。

背景技术：

1、近年来，用于人体组织损伤修复的生物医用材料获得了巨大研究进展，其中骨损伤修复材料一直是研究中的热点。羟基磷灰石(ha，ca10(po4)6(oh)2)是临床应用最为广泛的磷酸钙类材料之一，ha与活体组织之间具有良好的生物相容性和活性，是人工骨骼和组织工程中一种重要材料。但与人体自然形成的骨骼相比，ha材料仍有明显的缺陷，如韧性不足、脆性较大等。因此，骨损伤修复材料的力学性能需要能够提供足够的支撑，同时其降解周期需要合理匹配骨的再生速率，以利于骨长入。然而，基于损伤骨组织的修复是一个较为复杂和长期的过程，现有的各类骨修复材料普遍存在无法很好匹配骨再生速率的问题。

2、例如，现有的各种掺杂金属离子的骨修复材料，虽然能够将金属离子的作用发挥到促进成骨和骨生长中，更好地促进骨修复，然而大多数骨修复材料掺杂金属离子之后，无法实现控制金属元素的释放顺序和释放速率，以更好地匹配骨再生速率。

3、再如，有研究者开发出了各种用于骨修复的微球或纤维支架材料，这类材料虽然能够起到骨修复的效果，但由于材料种类繁多，采用的原料多为可降解生物材料，这些骨修复材料在植入后存在整体降解速率不可控，当材料的降解速率过快时，无法为骨修复提供足够的力学支撑；当材料的降解速率过慢时，又不利于新骨的长入和形成，因此这类材料仍然无法很好匹配骨再生的速率，在骨再生的不同阶段无法适应其性能要求。

4、因此，对于骨修复材料而言，如果能够很好控制支架材料的元素释放顺序和释放速率，以及具有较好力学性能和降解周期，使其最终能够很好匹配骨再生的速率，是骨修复能否成功的关键因素。然而，现有的骨修复材料均无法与骨修复时的再生速率相匹配，从而影响了骨修复的效果。

5、另一方面，在开发骨修复材料的过程中，研究人员还发现，线粒体功能障碍和糖代谢异常是骨免疫稳态破坏的关键问题。作为调节免疫细胞糖代谢的关键变阻器，恢复线粒体稳态可以有效对抗炎症并启动成骨。具体分为以下三个阶段：

6、第一阶段：调控巨噬细胞糖代谢平衡促炎/抗炎表型至关重要

7、糖代谢是控制巨噬细胞介导的炎性反应的重要事件，如何利用葡萄糖决定了巨噬细胞在免疫调节中的命运。作为人体免疫细胞的重要组成部分，巨噬细胞感知损伤信号被激活为促炎表型并分泌促炎因子和趋化因子用于抵抗感染、放大炎症反应、募集免疫细胞和再生相关细胞。然而，病理条件下不受控制的炎性巨噬细胞引起的炎症风暴会破坏机体免疫平衡，持续扩大炎性反应并最终导致组织修复失败。因此，保证巨噬细胞在合适的时机从促炎表型及时过渡到抗炎表型对维持损伤部位免疫微环境至关重要。研究表明，巨噬细胞通过糖酵解和氧化磷酸化介导的葡萄糖代谢发挥免疫调节功能，其特征是巨噬细胞增强葡萄糖摄取和糖酵解过程转变为促炎表型(m1)，增强脂肪酸氧化和氧化磷酸化过程转变为抗炎表型(m2)。因此，精准调控巨噬细胞糖代谢平衡促炎/抗炎转变对损伤后的组织修复至关重要。

8、第二阶段：维持线粒体稳态是调控巨噬细胞代谢重编程的有效途径

9、研究表明，线粒体与巨噬细胞的糖代谢密切相关，线粒体稳态失衡直接导致细胞氧化磷酸化过程被阻断，迫使细胞通过糖酵解途径获取能量。早期伤口巨噬细胞的有效激活依赖糖酵解和线粒体代谢共同调节。一方面，在急性损伤早期，巨噬细胞倾向于通过糖酵解而不是氧化磷酸化来快速供能并支持合成代谢。糖酵解产生能量的速率是氧化磷酸化的100倍，快速启动糖酵解产生的生物合成中间体(例如核苷酸)支持炎性巨噬细胞分泌多种促炎细胞因子，包括tnf-α、单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)、il-6和il-4/il-13，这增强了巨噬细胞对损伤微环境的适应性。尽管糖酵解过程发生在细胞基质中，但它依赖于线粒体功能，较高的糖酵解速率和局部环境中不断消耗的氧气导致细胞增殖过程中nadh与nad+比例失衡，这进一步导致氧化还原失衡，进而增加了活性氧(ros)的产生。另一方面，很大一部分糖酵解丙酮酸被转运到线粒体中进行氧化和atp产生，并通过产生大量ros来稳定hif-1α的表达促进伤口部位的血管新生，为组织愈合提供氧气和营养物质。在组织重塑阶段，巨噬细胞则依赖于氧化磷酸化和线粒体的毒物兴奋效应增加巨噬细胞适应性，延长其在组织中的存活时间进而发挥长期的组织重塑功能。同时，m2巨噬细胞产生大量抗炎介质参与组织重塑和修复，如il-10、tgf-β和ym1。因此，精准调控线粒体稳态以确保损伤组织中巨噬细胞从糖酵解及时过渡为氧化磷酸化至关重要。

10、第三阶段：线粒体是先天免疫和骨骼稳态的关键变阻器

11、线粒体作为先天免疫和骨骼稳态的关键变阻器，可通过调节免疫细胞(巨噬细胞为代表)的代谢状态来影响免疫应答，其功能状态直接影响先天免疫和骨骼稳态的正常进行。损伤骨组织中大量炎性巨噬向抗炎巨噬细胞的转变以及细胞间充质干细胞(mscs)向成骨细胞的分化过程，均依赖于线粒体从糖酵解到氧化磷酸化的代谢转变。特别地，线粒体来源的ros在糖代谢介导的巨噬细胞活化中起到至关重要的作用，其通过激活核因子κb(nf-κb)进入细胞核并诱导其磷酸化激活炎性巨噬细胞。因此，清除巨噬细胞线粒体ros，可有效地抑制nf-κb的激活，恢复线粒体功能稳态并阻断糖酵解，进而重编程巨噬细胞为抗炎表型。目前，多种生物活性材料被用来清除ros调控巨噬细胞功能转变，包括有机分子(n-乙酰基-l-半胱氨酸、α-生育酚和超氧化物歧化酶模拟物等)和无机纳米材料(ce基纳米材料，mn基纳米材料和量子点等)。然而，上述材料降解性能较差，靶向线粒体的效率较低、毒副性较高，无法持续性调控线粒体稳态，进而限制了其进一步应用。

12、因此，若能开发一种匹配组织免疫梯度且持续性调控线粒体功能稳态，加速恢复线粒体氧化磷酸化过程，阻断巨噬细胞持续的糖酵解途径的骨修复材料，将为先天免疫和骨骼稳态维持提供更强的适用性。

13、综上所述，如何获得一种能够很好匹配骨再生速率的支架材料，以及获得一种能够匹配组织免疫梯度且持续性调控线粒体功能稳态，阻断巨噬细胞持续的糖酵解途径的骨修复材料，以更好地促进骨修复，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种能够匹配时序骨再生的短纤维微球支架及制备方法与应用。本发明的技术目的在于，一方面解决现有的骨修复支架材料存在的元素释放顺序和释放速率不可控，以及力学性能和降解周期不合适，无法很好匹配骨再生速率的问题；另一方面解决现有的骨修复材料无法实现调控线粒体糖代谢，尚缺乏在骨愈合阶段不具有巨噬细胞糖代谢调控能力，无法实现糖代谢介导巨噬细胞功能转变加速骨再生过程的问题。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明首先提供了一种匹配时序骨再生的短纤维微球的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将硝酸锌与硝酸钙溶液按比例混合，然后与磷酸盐溶液共沉淀后获得锌掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒；再以聚乙烯醇为模板剂，环六亚甲基四胺为碱性溶液，将硝酸铈沉积在羟基磷灰石纳米颗粒表面，获得铈和锌掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒；

5、(2)将3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰到铈和锌掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒表面，获得带有氨基基团的纳米颗粒，然后利用酰胺反应将三苯基膦接枝在带有氨基基团的纳米颗粒表面，得到三苯基膦接枝的铈和锌掺杂羟基磷灰石纳米颗粒；

6、(3)以甲基丙烯酸酰化明胶、聚乳酸和六氟异丙醇组成纺丝液，通过静电纺丝设备形成均匀的纤维膜，将纤维膜破碎成静电纺丝短纤维；

7、(4)将步骤(2)所得三苯基膦接枝的铈和锌掺杂羟基磷灰石纳米颗粒与明胶通过微流控装置制备成微液滴，并通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺试剂发生edc交联，形成明胶基纳米羟基磷灰石微球；

8、(5)将步骤(2)所得明胶基纳米羟基磷灰石微球与步骤(3)所得静电纺丝短纤维悬液复合，经冻干后，采用光引发剂在紫外光下发生碳碳双键交联，得到匹配时序骨再生的短纤维微球。

9、本发明提供的上述制备方法首先采用化学沉淀法和碳二亚胺法合成了三苯基膦(tpp)和ce/zn离子修饰的羟基磷灰石(ceznha)，并将其封装在水凝胶微球(pla/gelma)中，然后利用光交联法引导短纤维(fm)和ceznha形成三维结构，创新性构建了一种离子激活的线粒体变阻器纤维-微球聚合体系(fm@ceznha)。其中，具有快降解速率的ceznha通过释放ce/zn离子靶向清除巨噬细胞线粒体氧化应激环境并恢复其代谢功能稳态，通过快速的氧化还原反应，促进巨噬细胞糖代谢通量从糖酵解过渡为氧化磷酸化，抑制了过度的早期炎症反应并快速启动成骨。而具有慢降解速率的fm网络提供稳定的巨噬细胞糖代谢转化平台，通过内部ceznha持续恢复其线粒体稳态并加速其形成骨化中心，实现了高效持续的巨噬细胞糖代谢介导的骨免疫级联反应。因此，本发明提供的短纤维微球能够实现元素的可控释放顺序和释放速率，实现与骨再生速率的匹配；同时线粒体变阻器纤维微球体系联合有效恢复了骨损伤早期的巨噬细胞线粒体代谢功能和糖代谢通量稳态，有效对抗炎症风暴并快速启动成骨过程，从而为骨缺损治疗开辟了一条新的途径。

10、本发明的上述合成方法中，zn离子和ce离子的掺杂方式以获得ceznha纳米颗粒的步骤极为关键。如本发明对比例所示，若是将zn离子和ce离子采用晶格掺杂的方式，将无法很好控制元素的比例；而当对zn离子和ce离子采用表面涂层的方式，虽然容易控制元素比例，但无法控制元素释放顺序和速率；只有当同时对zn离子对用晶格掺杂以及对ce离子采用表面涂层的方式，才能获得容易控制元素比例，且可控制元素的释放顺序和速率的效果，使得短纤维微球支架可匹配骨再生的速率。

11、同时，本发明中的纤维支架与微球的合成方法也极为关键。如本发明对比例所示，当将微球与纤维支架之间均通过edc交联时，支架材料整体的降解速率过快，无法提供很好的力学支撑；而当微球与纤维支架之间均通过碳碳双键交联时，支架材料整体降解速率较慢，不利于骨长入；只有当制备微球时采用edc交联，制备纤维支架时采用碳碳双键交联，才能使得支架材料整体降解速率可调，能够很好匹配骨再生的速率，且容易递送生物活性物质，实现高效的骨修复效果。

12、进一步的是，步骤(1)中所述硝酸锌与硝酸钙的摩尔比为0.1～1：1，硝酸钙与磷酸盐的摩尔比为1.2～1.8：1。

13、在此加以说明的是，步骤(1)中聚乙烯醇和环六亚甲基四胺聚乙烯醇的浓度并没有严格限定，建议的是，聚乙烯醇占纳米颗粒的重量比在1～10％范围内，环六亚甲基四胺的浓度在0.01～0.5m范围内均可。

14、进一步的是，步骤(2)中所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷与铈和锌掺杂的纳米颗粒的重量比为0.1～0.8：1；所述三苯基膦与带有氨基基团的纳米颗粒的重量比为0.1～1：1。

15、进一步的是，步骤(3)中所述聚乳酸的分子量为80000～100000da；所述甲基丙烯酸酰化明胶和聚乳酸的重量比为4：1。

16、进一步的是，步骤(3)中所述聚乳酸与甲基丙烯酸酰化明胶的重量比为0.1～1：1，聚乳酸与甲基丙烯酸酰化明胶的总重量占六氟异丙醇的重量比例为1～30％。

17、进一步的是，步骤(4)中所述edc交联的交联剂浓度为0.5m。

18、进一步的是，步骤(5)中所述光引发剂为lap(苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐)，发生碳碳双键交联的时间为5min。

19、本发明的目的之二是提供如上所述制备方法得到的能够匹配时序骨再生的短纤维微球。

20、本发明的目的之三是提供如上所述能够匹配时序骨再生的短纤维微球在作为骨修复材料方面的应用。

21、本发明的有益效果如下：

22、(1)本发明提供了一种将短纤维与水凝胶微球进行聚合，并引导ce和zn掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒进行复合，创新地构建出可控释放金属离子顺序和释放速率，以及其降解速率能够匹配骨再生速率的支架材料，同时还能够恢复巨噬细胞线粒体功能和糖代谢通量的线粒体变阻器纤维微球支架。该纤维微球支架能够实现更好的骨修复效果。

23、(2)本发明提供的纤维微球支架，其中ceznha能够动态清除巨噬细胞线粒体的ros并恢复其功能稳态，纤维网络提供稳定的巨噬细胞糖代谢转化平台，两者联合高效持续地加速巨噬细胞由糖酵解转变为氧化磷酸化，实现了氧化应激下的巨噬细胞免疫稳态和糖代谢协调的免疫-成骨级联过程。该短纤维-微球构筑的线粒体变阻器通过恢复线粒体功能并调节巨噬细胞糖代谢为各类组织损伤的修复提供了新的思路。

技术特征：

1.一种匹配时序骨再生的短纤维微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硝酸锌与硝酸钙的摩尔比为0.1～1：1，硝酸钙与磷酸盐的摩尔比为1.2～1.8：1。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷与铈和锌掺杂的纳米颗粒的重量比为0.1～0.8：1。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述三苯基膦与带有氨基基团的纳米颗粒的重量比为0.1～1：1。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述聚乳酸的分子量为80000～100000da；所述甲基丙烯酸酰化明胶和聚乳酸的重量比为4：1。

6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述聚乳酸与甲基丙烯酸酰化明胶的重量比为0.1～1：1，聚乳酸与甲基丙烯酸酰化明胶的总重量占六氟异丙醇的重量比例为1～30％。

7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述edc交联的交联剂浓度为0.5m。

8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述光引发剂为lap，发生碳碳双键交联的时间为5min。

9.权利要求1-8任一项所述制备方法得到的能够匹配时序骨再生的短纤维微球。

10.权利要求9所述的能够匹配时序骨再生的短纤维微球在作为骨修复材料方面的应用。

技术总结
本发明提供了一种能够匹配时序骨再生的短纤维微球支架及制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。本发明提供的短纤维微球支架，快降解速率的CeZnHA释放Ce和Zn离子靶向清除巨噬细胞线粒体氧化应激环境并恢复其代谢功能稳态，通过快速的氧化还原反应，促进巨噬细胞糖代谢通量从糖酵解过渡为氧化磷酸化，抑制过度早期炎症反应并快速启动成骨。慢降解速率的纤维网络提供稳定的巨噬细胞糖代谢转化平台，通过内部CeZnHA持续恢复其线粒体稳态并加速形成骨化中心。本发明的短纤维微球支架能够很好匹配骨再生的速率，并有效恢复了骨损伤早期的巨噬细胞线粒体代谢功能和糖代谢通量稳态，有效对抗炎症风暴并快速启动成骨过程，为骨缺损治疗开辟了一条新的途径。

技术研发人员：崔文国,张宏博,庄彭真,王娟
受保护的技术使用者：上海市伤骨科研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5