一种mRNA表达载体、其构建方法和应用与流程

本发明属于生物医药产业领域，尤其涉及一种mrna表达载体、其构建方法和应用。

背景技术：

1、mrna技术是生物医药产业领域近几年发展最迅猛的技术之一，其技术优势和商业潜力已经被mrna-1273和bnt162b2等新冠疫苗充分证实，利用mrna技术制作传染病预防性疫苗或肿瘤等疾病的治疗性疫苗或药物已越来越常见。

2、mrna技术的产业化离不开体外转录技术(ivt)的发展，质粒作为体外转录的主要原料之一，直接影响着mrna的产业化生产。为了更好的利用mrna技术开发疫苗和药物，本申请设计了一种既能在细胞中高效表达蛋白质，又能在体外高效转录的载体质粒。该质粒序列包括负责质粒在原核细胞内复制和扩增的区域和负责质粒所携带的基因转录的区域；其中参与质粒复制和扩增的区域主要包括复制子和抗性基因等元件，负责基因转录的区域包括启动子、加帽位点、5’-非翻译区(5’utr)、基因编码序列(cds)、3’非翻译区(3’utr)、多聚腺苷(poly a)区和线性化酶切位点等原件。

技术实现思路

1、本发明提供了一种新型的mrna载体、其制备方法和应用。

2、本发明提供一种mrna表达载体，其包括从5’端至3’端的如下元件：

3、5’utr、编码目的蛋白的开放阅读框、3’utr以及poly a；

4、其中，5’utr选自cyba、den2、hhbb、rpl38、rps25、tcv或top；

5、3’utr选自hhba1、hhbb、bydv、hhbbx2、cyba_1.5x、bmv、tsv或tcv；

6、poly a为选自60a、100a、30a-10x-70a、30a-10x-70a-10c-a或40a-10x-60a-10c-a。

7、优选地，5’utr为cyba、den2或hhbb，3’utr为hhbbx2，poly a为100a或30a-10x-70a。

8、具体实施方式中，其是非复制型mrna表达载体或复制型mrna表达载体。

9、更具体地，其适用于在原核生物扩繁，尤其适用于在大肠杆菌扩繁，进一步地，所述载体采用puc复制子；或者适用于真核生物表达目的蛋白。

10、所述载体还包括启动子；具体为cmv启动子或t7启动子，或串联的cmv启动子和t7启动子；还携带抗性基因，例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因。

11、具体地，所述mrna表达载体的骨架为pkl载体骨架。

12、进一步地，所述载体还包括下述任意之一的元件：加帽位点、酶切位点、信号肽表达元件、标签蛋白元件。

13、在一个具体实施方式中，所述载体的骨架为pkl载体骨架。

14、在具体实施方式中，所述表达载体包含能够表达选自以下组中至少一种的目的蛋白的mrna：是酶、抗原蛋白、抗体蛋白、诊断或治疗性蛋白或药物；优选地，所述目的蛋白选自人乳头瘤病毒(hpv)蛋白、呼吸道合胞病毒(rsv)蛋白、或新型冠状病毒蛋白。

15、本发明还提供所述的mrna表达载体在表达目的蛋白或制备mrna中的应用。

16、具体地，其是在体内表达目的蛋白，或在体外获得编码目的蛋白的mrna。所述编码目的蛋白或rna没有特别限制，可以是用于治疗用途的蛋白或rna，以及其他用途的蛋白或rna。

17、本发明还提供一种含有所述的mrna表达载体制得的mrna分子的组合物，其由所述mrna分子以包装体形式存在，或者还含有递送所述mrna分子的递送系统，或者药学上可接受的运载体；例如，所述递送系统适用的呼吸道递送、滴鼻、口服、注射、黏膜给药。

18、在一个具体实施方式中，所述组合物中的mrna分子为mrna疫苗，更具体地，所述mrna疫苗包含编码人乳头瘤病毒蛋白、呼吸道合胞病毒蛋白、或新型冠状病毒蛋白的mrna分子。

19、本申请通过优化不同5’utr、3’utr和poly a的组合，对luci蛋白表达影响不同，其中有5个组合整体表现优于bnt162b2的5’utr、3’utr和poly a组合。5种组合的5’utr-3’utr-poly a分别为cyba-hhbbx2-100a、den2-hhbbx2-100a、hhbb-hhbbx2-100a、den2-hhbbx2-30a-10x-70a、hhbb-hhbbx2-30a-10x-70a(10x序列为gctcacgtct)。

20、为了验证上述质粒的谱适性，本发明也采用上述最佳的5’utr、3’utr和poly a的组合用于表达hpv、rsv和新型冠状病毒蛋白的mrna疫苗，效果表现良好，如此进一步验证了本发明构建的特定的5’utr、3’utr和poly a的组合，及其质粒具有谱适性，可用于表达各种不同的mrna。因此，本发明通过特定的5’utr、3’utr和poly a的组合，可以大幅提高目的蛋白和rna的产量。本发明的mrna表达载体可用于制备酶、抗原蛋白、抗体蛋白、诊断或治疗性蛋白或药物以及mrna疫苗，具有较大应用价值。

技术特征：

1.一种mrna表达载体，其特征在于，其包括从5’端至3’端的如下元件：5’utr、编码目的蛋白的开放阅读框、3’utr和poly a；

2.如权利要求1所述的mrna表达载体，其特征在于，5’utr元件为cyba、den2或hhbb，3’utr元件为hhbbx2，poly a为100a或30a-10x-70a。

3.如权利要求1或2所述的mrna表达载体，其特征在于，其是非复制型mrna表达载体或复制型mrna表达载体。

4.如权利要求1至3任一项所述的mrna表达载体，其特征在于，其适用于在原核生物扩繁，尤其适用于在大肠杆菌扩繁，进一步地，所述载体采用puc复制子；或者适用于真核生物表达目的蛋白。

5.如权利要求1所述的mrna表达载体，其特征在于，还包括启动子；具体为cmv启动子或t7启动子，或串联的cmv启动子和t7启动子；还携带抗性基因，例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因。具体地，所述mrna表达载体的骨架为pkl载体骨架。

6.如权利要求1所述的mrna表达载体，其特征在于，还包括下述任意之一的元件：加帽元件、酶切位点、信号肽表达元件、标签蛋白元件。

7.如权利要求1所述的mrna表达载体，其特征在于，所述表达载体包含能够表达选自以下组中至少一种目的蛋白的mrna：酶、抗原蛋白、抗体蛋白、诊断或治疗性蛋白或药物。

8.如权利要求1至7任一项所述的mrna表达载体在表达目的蛋白或rna中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，其是在体内表达目的蛋白，或在体外获得编码目的蛋白的mrna。

10.一种含有如权利要求1至7任一项所述的mrna表达载体制得的mrna分子的组合物，其特征在于，由所述mrna分子以包装体形式存在，或者还含有递送所述mrna分子表达载体的递送系统，或者药学上可接受的运载体；例如，所述递送系统适用的呼吸道递送、滴鼻、口服、注射、黏膜给药；

技术总结
本发明属于生物医药产业领域，尤其涉及一种mRNA表达载体、其构建方法和应用。本发明通过特定的5’UTR、3’UTR和poly A的组合，可以大幅提高目的蛋白和RNA的表达。本发明的mRNA表达载体可用于制备酶、抗原蛋白、抗体蛋白、诊断或治疗性蛋白或药物以及mRNA疫苗，具有较大应用价值。

技术研发人员：杨建国,吴依昕,李文华,王雪,丛丽圆,刘玉莹,伍树明,张海江,刘永江
受保护的技术使用者：北京康乐卫士生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5