一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法及其特征图谱和应用与流程

本发明属于中成药质量控制与评价，具体涉及一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法及其特征图谱和应用。

背景技术：

1、小儿咽扁颗粒(国药准字z20055645)属于中成药，收载于《中国药典》(2020年版)第一部，由金银花、射干、金果榄、桔梗、玄参、麦冬、人工牛黄(体外培养牛黄)和冰片八味药材组成，具有清热利咽，解毒止痛的功效，陕西盘龙药业集团股份有限公司生产的小儿咽扁颗粒所用的是体外培育牛黄，疗效更优。方中金银花性味甘寒，入肺、胃、大肠经，有清热解毒，宣散风热，凉血止血的功效，其主要活性成分为绿原酸、异绿原酸c和异绿原酸a等；射干苦寒降泄，专入肺经，长于清泄肺火，有清热解毒、祛痰利咽的功效，是治疗热毒、痰火郁结所导致的咽喉肿痛的要药，其主要成分为射干苷和次野鸢尾黄素。金银花与射干二药合用，共为君药。桔梗为桔梗科植物桔梗的干燥根，气微，味微甜后苦，具有宣肺利咽、祛痰排脓的功效，其主要成分为黄芪甘、桔梗皂苷d等；金果榄性味苦寒，具有清热解毒、滋阴降火、止渴生津等功效，其主要成分为古伦宾；玄参苦咸微寒，具有清凉解热、滋阴降火、解毒散结的功效，其主要成分为桃叶珊瑚苷、毛蕊花糖苷；麦冬甘微苦寒，清心润肺，泻热除烦，消痰止咳，主要成分为甲基麦冬黄烷酮a、甲基麦冬高黄酮a，四药相配，共奏滋阴宣肺，合为臣药。玄参主要活性成分为哈巴苷及哈巴俄苷，哈巴苷具有抗炎、抗氧化及调节免疫等多重生物活性，而哈巴俄苷则进一步增强玄参在清热解毒、滋阴降火方面的疗效，两者协同，赋予玄参显著的药理作用；人工牛黄具有清心豁痰、开窍醒神的功效，其主要成分为胆酸、猪去氧胆酸等，玄参与人工牛黄二者合用，共为佐药。在临床上，小儿咽扁颗粒可用于治疗小儿肺胃热盛所致的喉痹、乳蛾，症见咽喉肿痛、咳嗽痰盛、口舌糜烂、急性咽炎、急性扁桃腺炎等症状。

2、目前关于小儿咽扁颗粒的质量检测较少，且多数为方中单一成分或单味药材研究，不能反映小儿咽扁颗粒的整体成分。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法及其特征图谱和应用，用以解决现有检测方法无法反映小儿咽扁颗粒的整体成分的技术问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明的第一个方面，公开了一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

4、s1、以含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒为供试品；

5、s2、以射干苷、古伦宾、隐绿原酸、3，5-二-o-咖啡酰奎宁酸、次野鸢尾黄素、绿原酸、异绿原酸c、紫丁香苷、毛蕊花糖苷、野鸢尾苷、芦丁、金丝桃苷、异毛蕊花糖苷、安格洛苷c和哈巴俄苷为对照品；

6、s3、采用高效液相色谱法分析测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的色谱图；

7、s4、将s3中获得的供试品溶液色谱图导入中药色谱特征图谱相似度评价系统并进行相似度分析，确认结果的可靠性；

8、s5、根据s3得到的供试品溶液色谱图和对照品溶液的色谱图，并结合由高分辨质谱得到的总离子流图以及化学成分的质谱图，确定特征图谱中各峰的化学成分。

9、优选地，s1中，含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒的供试品溶液的制备方法为：分别称取不同批次的含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒粉末，50％甲醇溶液溶解后，提取，得到含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒的供试品溶液。

10、进一步优选地，s1中，采用超声提取45min。

11、优选地，s2中，对照品溶液的制备方法为：分别精密称取射干苷、古伦宾、隐绿原酸、3，5-二-o-咖啡酰奎宁酸、次野鸢尾黄素、绿原酸、异绿原酸c、紫丁香苷、毛蕊花糖苷、野鸢尾苷、芦丁、金丝桃苷、异毛蕊花糖苷、安格洛苷c和哈巴俄苷溶解，分别制成0.97mg/ml射干苷对照品溶液、0.89mg/ml古伦宾对照品溶液、0.97mg/ml隐绿原酸对照品溶液、0.97mg/ml 3，5-二-o-咖啡酰奎宁酸对照品溶液、0.68mg/ml次野鸢尾黄素对照品溶液、0.67mg/ml绿原酸对照品溶液、0.79mg/ml异绿原酸c对照品溶液、0.99mg/ml紫丁香苷对照品溶液、0.77mg/ml毛蕊花糖苷对照品溶液、0.50mg/ml野鸢尾苷对照品溶液、0.55mg/ml芦丁对照品溶液、0.99mg/ml金丝桃苷对照品溶液、0.69mg/ml异毛蕊花糖苷对照品溶液、0.98mg/ml安格洛苷c对照品溶液和0.68mg/ml哈巴俄苷对照品溶液。

12、进一步优选地，s2中，采用50％甲醇溶液溶解。

13、优选地，s3中，高效液相色谱条件为：色谱柱：shim-pack vp-ods，250mm×4.6mm，5μm色谱柱；检测器：紫外可见吸收检测器，检测波长为230nm；体积流量：1.0ml/min；进样量：10μl，柱温为30℃。

14、进一步优选地，s3中，以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸水溶液为流动相c，梯度洗脱程序如下表所示：

15、

16、优选地，s4中，将s3中获得的不同批次小儿咽扁颗粒供试品溶液色谱图导入中药色谱特征图谱相似度评价系统；选择不同批次小儿咽扁颗粒供试品溶液的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，用平均值计算法生成小儿咽扁颗粒的对照图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；经过数据导入、多点矫正和数据匹配，进行相似度分析；获得不同批次小儿咽扁颗粒供试品溶液的色谱图与共有峰模式之间的相似度结果表并导出；根据相似度结果表及小儿咽扁颗粒供试品溶液的色谱图，确认结果的可靠性。

17、优选地，s5中，高分辨质谱的检测条件为：电喷雾电离，喷雾电压3500v，鞘气流速40arb，辅助气流速10arb，毛细管温度300℃，辅助气温度300℃，扫描模式为全扫描模式，质荷比扫描范围m/z为100～1300。

18、进一步优选地，s5中，对供试品溶液进行高分辨质谱分析，将检测数据导入xcalibur软件，进入qual browser界面，根据色谱图出峰情况进行数据分析，得到总离子流图以及各化学成分的质谱结果图。

19、本发明的第二个方面，公开了上述构建方法获得的含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒特征图谱。

20、本发明的第三个方面，公开了一种鉴定含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒特征图谱的方法，利用上述构建方法获得的含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒特征图谱进行鉴定。

21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

22、本发明提供的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，采用高效液相色谱-高分辨质谱联用的方法，有效体现含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征峰的位置及其数目，实现同时对含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒中多味药材和多种药效成分的检测(非聚焦于某一单一成分或单味药材)。相对于现有小儿咽扁颗粒的特征图谱构建方法，用本方法所建立的小儿咽扁颗粒的特征图谱共计48个共有峰，对其中主要的15个特征峰进行指认，覆盖金银花、桔梗、玄参、射干、金果榄5味药材，有助于对含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒进行快速、高效的质量控制，并从整体上控制小儿咽扁颗粒的成分与含量。通过对所构建的特征图谱方法进行方法学考察(包括精密度试验、重复性试验和稳定性试验)，结果的相似度值均高于0.99，表明该方法重现性好，能够满足大批量样本分析测试需求，为小儿咽扁颗粒质量控制提供技术支持与理论参考。通过该方法得到的含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱，信息量多，相似度高，稳定性好，准确度高，重现性好，成分含量高，可以全面、准确、清晰、客观地检测和评价含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒的质量，有利于更全面、更有效地控制其临床用药的质量，安全性和疗效得到更好的保障，弥补含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒在成分检测方面的不足，对于含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒的成分鉴别、质量评价、质量标准的制定以及保证临床疗效具有重要作用和价值。

23、进一步地，在供试品溶液的制备过程中，以50％甲醇溶液作为提取溶剂，提取物色谱图信息量最多，成分含量最高。

24、进一步地，在供试品溶液的制备过程中，采用超声提取，得到的色谱图成分全面，分离度良好。超声提取45min，所得到的色谱图成分含量最高，峰形好，且分离度高。

25、进一步地，高效液相色谱法分析测定过程中，检测波长条件为230nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳。柱温保持30℃时出峰情况最佳，各成分分离效果较好。

26、进一步地，高效液相色谱法分析测定过程中，以乙腈-0.1％磷酸为流动相时，小儿咽扁颗粒中各成分分离效果较好。采用洗脱程序6时分离度良好，峰高较高，基线平稳，色谱信息完整。

技术特征：

1.一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s1中，含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒的供试品溶液的制备方法为：分别称取不同批次的含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒粉末，50％甲醇溶液溶解后，提取，得到含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒的供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s1中，采用超声提取45min。

4.根据权利要求1所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s2中，对照品溶液的制备方法为：分别精密称取射干苷、古伦宾、隐绿原酸、3，5-二-o-咖啡酰奎宁酸、次野鸢尾黄素、绿原酸、异绿原酸c、紫丁香苷、毛蕊花糖苷、野鸢尾苷、芦丁、金丝桃苷、异毛蕊花糖苷、安格洛苷c和哈巴俄苷溶解，分别制成0.97mg/ml射干苷对照品溶液、0.89mg/ml古伦宾对照品溶液、0.97mg/ml隐绿原酸对照品溶液、0.97mg/ml 3，5-二-o-咖啡酰奎宁酸对照品溶液、0.68mg/ml次野鸢尾黄素对照品溶液、0.67mg/ml绿原酸对照品溶液、0.79mg/ml异绿原酸c对照品溶液、0.99mg/ml紫丁香苷对照品溶液、0.77mg/ml毛蕊花糖苷对照品溶液、0.50mg/ml野鸢尾苷对照品溶液、0.55mg/ml芦丁对照品溶液、0.99mg/ml金丝桃苷对照品溶液、0.69mg/ml异毛蕊花糖苷对照品溶液、0.98mg/ml安格洛苷c对照品溶液和0.68mg/ml哈巴俄苷对照品溶液。

5.根据权利要求4所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s2中，采用50％甲醇溶液溶解。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s3中，高效液相色谱条件为：色谱柱：shim-pack vp-ods，250mm×4.6mm，5μm色谱柱；检测器：紫外可见吸收检测器，检测波长为230nm；体积流量：1.0ml/min；进样量：10μl，柱温为30℃。

7.根据权利要求6所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s3中，以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸水溶液为流动相c，梯度洗脱程序如下表所示：

8.根据权利要求1～5任意一项所述的一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，s5中，高分辨质谱的检测条件为：电喷雾电离，喷雾电压3500v，鞘气流速40arb，辅助气流速10arb，毛细管温度300℃，辅助气温度300℃，扫描模式为全扫描模式，质荷比扫描范围m/z为100～1300。

9.权利要求1～8任意一项所述的构建方法获得的含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒特征图谱。

10.一种鉴定含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒特征图谱的方法，其特征在于，利用权利要求1～8任意一项所述的构建方法获得的含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒特征图谱进行鉴定。

技术总结
本发明公开了一种含体外培育牛黄的小儿咽扁颗粒特征图谱的构建方法及其特征图谱和应用，属于中成药质量控制与评价技术领域。以含体外培育牛黄小儿咽扁颗粒为供试品；以射干苷、古伦宾、隐绿原酸、3，5‑二‑O‑咖啡酰奎宁酸、次野鸢尾黄素、绿原酸、异绿原酸C、紫丁香苷、毛蕊花糖苷、野鸢尾苷、芦丁、金丝桃苷、异毛蕊花糖苷、安格洛苷C和哈巴俄苷为对照品；采用高效液相色谱法分析测定，得到对应的色谱图；对供试品溶液色谱图进行相似度分析，确认结果的可靠性；根据供试品溶液色谱图、对照品溶液的色谱图、高分辨质谱得到的总离子流图以及化学成分的质谱图，确定特征图谱中各峰的化学成分。

技术研发人员：张德柱,谢晓林,孟建国,马钊,梁承远,陈梦欣,韦美艳,邓新桃,柯昌华,刘玉婷,田蕾,张佳运
受保护的技术使用者：陕西盘龙药业集团股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5