一种用于检测柑橘木虱的PCR引物及其检测方法
本发明属于害虫防治领域，具体涉及一种用于检测柑橘木虱的pcr引物及其检测方法。
背景技术：
1、柑橘木虱(diaphorina citri)是橘果园黄龙病(citrus huanglongbing，hlb)传播蔓延最重要的途径。柑橘木虱是半翅目木虱科昆虫，柑橘木虱在中国各省柑橘产区均有分布，成虫分散在叶片背面叶脉和嫩芽上取食并栖息。卵产于嫩芽缝隙或幼嫩叶片上。主要以成虫和若虫为害寄主作物的嫩芽和新稍。成、若虫刺吸嫩芽、幼叶和嫩稍汁液，被害的嫩芽和新稍干枯萎缩，新叶扭曲畸形，排泄物诱发烟煤病。因此，其在芸香科植物上的活动会残留大量dna，一般称为环境dna。收集并检测其残留的环境dna，可以追踪柑橘木虱dna的活动轨迹，判断柑橘木虱的防控效果，预测柑橘木虱种群动态与消长。
技术实现思路
1、本发明的目的是根据生物信息预测的物种独有基因(孤儿基因)设计pcr引物，提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的用于检测柑橘木虱的pcr引物，以及柑橘木虱单管巢式pcr检测方法。
2、另一方面，本发明的柑橘木虱单管巢式pcr检测方法在柑橘果园实际应用，是以拭子上收集到的柑橘木虱dna为模版，应用上述的特异性引物对，在单个pcr反应管内进行pcr扩增，检测pcr产物，获得285bp pcr产物的待测柑橘木虱。
3、本发明的用于检测柑橘木虱的pcr引物，包括dcf1引物和/或dcf2引物；
4、所述的dcf1引物包括：dcf1:5’-gtggaggaacacagcacgttaggaa-3’和dcr1:5’-tgcagacgcagctgagatttctgag-3’；
5、所述的dcf2引物包括：dcf2:5’-gtatcaccatgcactgca-3’和dcr2:5’-atatgtggcttcacccct-3’。
6、本发明的第二个目的是提供一种用于检测柑橘木虱的试剂盒，其含有上述pcr引物。
7、本发明的第三个目的是提供一种用于检测柑橘木虱的方法，其是采集待测昆虫或者柑橘木虱生境中的环境dna，然后用上述dcf1引物或dcf2引物或它们的组合进行pcr扩增，电泳检测待测引物，dcf1引物扩增的产物在527bp处，dcf2引物扩增的产物在285bp处，dcf1引物和dcf2引物扩增的产物在285bp处。
8、优选，当利用dcf1引物扩增时，其反应程序是95℃预变性3min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸7min。
9、优选，当利用dcf2引物扩增时，其反应程序是95℃预变性3min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸7min。
10、优选，当利用dcf1引物和dcf2引物时，其反应程序是95℃预变性3min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min。
11、优选，当利用dcf1引物和dcf2引物时，其反应体系是50μl pcr反应体系各组份为：10×easy taq buffer 5μl，high pure dntps 4μl，easy tap dna polymerase 1μl，0.1μmdcf1/dcr1 1μl，10μm dcf2/dcr2 1μl，待测模板dna 1μl(20ng/l～30ng/μl)，加ddh2o至50μl。
12、目前尚未有针对环境dna监测柑橘木虱的专利方法与研究论文，由于环境dna具有载量低、易污染的特点，为了增加环境dna的检出灵敏度、增加特异性、减少假阳性，本专利通过比对柑橘木虱基因组与其他昆虫基因组，挑选柑橘木虱基因组特有孤儿基因，设计巢式pcr引物，利用内外引物退火温度差，构建单管巢式pcr反应体系，增加灵敏度的同时，减低了非特异性与污染造成的假阳性。
13、本发明中通过柑橘木虱基因组比对筛选出特有的孤儿基因作为检测靶标，构建了一种新型的单管巢式pcr反应体系，实现了高灵敏度与高特异性的同时，简化了操作步骤，降低了污染风险，提高检测特异性。同时，将单管巢式pcr与环境dna监测技术结合应用于柑橘木虱的监测与防控中，填补了该领域的技术空白，为果园柑橘木虱的监测与预测提供了新的思路和方法。
技术特征：
1.一种用于检测柑橘木虱的pcr引物，其特征在于，包括dcf1引物和/或dcf2引物；
2.一种用于检测柑橘木虱的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的pcr引物。
3.一种用于检测柑橘木虱的方法，其特征在于，是采集待测昆虫或者柑橘木虱生境中的环境dna，然后用权利要求1中的dcf1引物或dcf2引物或它们的组合进行pcr扩增，电泳检测待测引物，dcf1引物扩增的产物在527bp处，dcf2引物扩增的产物在285bp处，dcf1引物和dcf2引物扩增的产物在285bp处。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当利用dcf1引物扩增时，其反应程序是95℃预变性3min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸7min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当利用dcf2引物扩增时，其反应程序是95℃预变性3min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸7min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当利用dcf1引物和dcf2引物时，其反应程序是95℃预变性3min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当利用dcf1引物和dcf2引物时，其反应体系是50μl pcr反应体系各组份为：10×easy taq buffer 5μl，high pure dntps 4μl，easytap dna polymerase 1μl，0.1μm dcf1/dcr1 1μl，10μm dcf2/dcr2 1μl，待测模板dna1μl(20ng/l～30ng/μl)，加ddh2o至50μl。
技术总结
本发明公开了一种用于检测柑橘木虱的PCR引物及其检测方法。包括DcF1引物和/或DcF2引物；所述的DcF1引物包括：DcF1:5’‑GTGGAGGAACACAGCACGTTAGGAA‑3’和DcR1:5’‑TGCAGACGCAGCTGAGATTTCTGAG‑3’；所述的DcF2引物包括：DcF2:5’‑GTAT CACCATGCACTGCA‑3’和DcR2:5’‑ATATGTGGCTTCACCCCT‑3’。本专利通过比对柑橘木虱基因组与其他昆虫基因组，挑选柑橘木虱基因组特有孤儿基因，设计巢式PCR引物，利用内外引物退火温度差，构建单管巢式PCR反应体系，增加灵敏度的同时，减低了非特异性与污染造成的假阳性。
技术研发人员：陈大嵩,张胜强,段海涛,欧阳革成,孟翔
受保护的技术使用者：广东省科学院动物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5