串联基序用于构建定向二硫键多环肽文库和发现多环肽配体

本发明涉及环肽类化合物，尤其是涉及串联基序构建定向二硫键多环肽文库和发现多环肽配体。

背景技术：

1、近年来，环肽类分子作为一种具有吸引力的疾病诊断和治疗工具的分子形式，越来越受到人们关注。环肽分子通过共价键约束肽链结构，不像蛋白质那样必须借助庞大的非共价相互作用核心，来保持整个分子稳定的三维结构。环肽分子与蛋白质相比具有更大的表面积体积比。环肽分子中一个特别有趣的例子是天然存在的富含二硫键多肽(drps)，它们主要通过二硫键约束肽链结构。drps序列中的大多数非半胱氨酸残基可在不损害结构完整性情况下发生突变，因此可以通过分子进化手段实现这些drps的功能多样化，以结合各种生物靶标。

2、目前开发靶向不同靶标的富含二硫键多肽分子的主要方法有两种。其一是基于自然界存在的天然drp分子，将部分氨基酸序列随机化作为环肽骨架，并嫁接多肽活性表位或构建随机多肽文库来筛选活性序列，赋予多肽全新的功能。然而，天然drps的二硫键结构保守性却限制drps的结构多样性——天然drps仅具有几类折叠方式，包括胱氨酸结、胱氨酸稳定的α/β折叠及三指毒素折叠等。近年来，发展出一类通过基序制导二硫键折叠，开发具有不同功能多元环肽的新方法。这种方法不需要借助天然环肽骨架和非天然氨基酸插入，仅需要固定二硫键定向制导基序，就能有效提升多肽的氧化折叠效率，扩大多肽序列随机化修饰的范围。同时，该方法能有效与目前环肽配体开发的各种方法结合，包括活性表位嫁接、噬菌体文库构建及筛选、酵母菌文库构建及筛选、mrna展示文库构建及筛选等方法。这类通过基序制导的多肽也被称为定向二硫键多环肽(disulfide-directed multicyclicpeptide，ddmps)，定向二硫键多环肽是一类特殊的富含二硫键多肽，通过二硫键定向制导基序获得稳定的多元环构象，并能与多种靶标高亲和力结合，能作为药物设计的前体。基于二硫键定向制导基序能设计出大量耐受序列修改的多元环肽模板，拓展天然drps有限的折叠结构模板。目前已经报道靶向多种生物靶标蛋白的ddmps分子，包括cppc基序制导的靶向cd28的环肽drp8、靶向mdm2的drp1、靶向keap1的drp6、cpxxc基序制导的靶向her2的环肽l-5、靶向fgfr1的环肽l-3、cxc基序制导的靶向mdm2的环肽pb13等。

3、目前已发现的二硫键定向制导基序仅三种(cppc、cxc和cpxxc)，且仅能用于构建高效氧化折叠双环肽和三元环肽骨架。然而，大于三元的多环肽的理论异构体数目均多于100种(例如同一含有八个半胱氨酸残基的多肽链氧化后理论上可产生的四元环肽异构体数目为105种)，而这些基序制导能力有限，难以直接用于制导四元环肽及其以上环肽的二硫键配对。为探索序列空间中具有更高亲和力的多元环肽分子，本发明致力于提供制导能力多样化的串联基序，开发二硫键精确配对的环肽文库，从而筛选性能更优异的功能多元环肽分子。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于针对现有ddmps开发过程中可使用二硫键定向制导基序较少等问题，为拓展多元环肽骨架和结构多样性，提供一组具有新颖制导二硫键折叠性质的二硫键定向制导基序，称为串联基序；可将串联基序运用于调控半胱氨酸的精确配对，将两个不同串联基序插入多肽序列中，能有效调控肽链二硫键配对及多肽折叠，提升多肽氧化折叠效率。

2、本发明的第二目的在于提供所述一组串联基序用于构建定向二硫键多环肽文库和发现多环肽配体的应用。通过在肽链中插入不同串联基序，实现构筑四元环拓扑结构的ddmp骨架。该骨架无需借用天然富含二硫键多肽的氧化折叠模板，可用于直接构建全随机化的多肽生物展示文库提供串联基序制导的三元环肽模板。实现四元环肽分子内四对二硫键的精准配对。结合噬菌体展示技术，将四元环肽模板融合表达与噬菌体表面，构建噬菌体四元环肽库，充分说明串联基序制导多元环肽法与生物展示技术间具有良好相容性。

3、本发明的第三目的在于提供所述定向二硫键多环肽文库筛选的多环肽配体在作为化学生物学的研究工具及潜在治疗性药物设计的前体分子中应用。结合nmr，测定两个活性ddmp的结构及二硫键配对，说明本方法能有效提供全新结构的ddmp分子。结合荧光标记，将亲和ddmp用作细胞表面靶蛋白的检测探针分子，说明本发明得到的ddmp有作为化学生物学的研究工具及潜在治疗性药物的前体。

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

5、本发明提供一组串联基序，分别为cppcxc、cxcppc、cppcpxxc、cpxxcppc、cxcpxxc、cpxxcxc、cxcxc、cppcppc和cpxxcpxxc；其中，c代表半胱氨酸，p代表脯氨酸、x代表任意氨基酸。

6、所述一组串联基序由二硫键制导基序cppc、cpxxc和cxc作为构建模块串联组合而成，在基序之间共享一个半胱氨酸，使得各个基序在功能上和结构上形成一个整体，共享的半胱氨酸在多肽链中形成基序间二硫键，稳定肽链的折叠状态。

7、所述串联基序cppcxc、cxcppc、cppcpxxc、cpxxcppc、cppcppc和cxcxc均具有较强的平行配对倾向，且耐受不同数量和位置的基序内氨基酸突变，这些基序均可驱动多肽二硫键交换反应向串联基序平行配对的方向进行。

8、所述串联基序cpxxcxc、cxcpxxc和cpxxcpxxc基序具有一定的反平行配对倾向，能驱动多肽产生稳定的平行配对异构体和反平行配对异构体，且基序内可突变氨基酸数目不一致。二硫键配对方式通过选择不同的串联基序组合实现。

9、本发明提供所述串联基序用于设计二硫键制导的多元环肽文库和发现多功能环肽配体的方法。其中包括以下步骤：

10、(1)选取串联基序设计定向二硫键多环肽骨架的模板：

11、模板a：—aam—a—aan—

12、模板b：—aam—a—aan—b—aao—

13、模板c：—aam—a—aan—c—aao—c—aap—a—aaq—

14、其中，a代表所述一组串联基序(cppcxc、cxcppc、cppcpxxc、cxcpxxc、cxcpxxc、cpxxcxc、cxcxc、cppcppc和cpxxcpxxc)中的任一，b代表串联基序、其他二硫键定向制导基序(cppc、cxc和cpxxc)或额外半胱氨酸，c代表额外半胱氨酸，aa代表任意一个氨基酸，m、n、o、p和q均代表任意氨基酸的数目；模板b中，a和b的位置可以交换；模板c中，a和c之间的位置可以交换；

15、(2)构建定向二硫键多环肽文库

16、选取步骤(1)中三种模版之一作为环肽骨架构建多元环肽文库。

17、a、根据步骤(1)中串联基序骨架，合成含有如下序列的dna核酸片段，翻译后形成含有二硫键的环肽结构：

18、tgcccgccgtgcnnktgc，翻译后为cppcxc；

19、tgcnnktgcccgccgtgc，翻译后为cxcppc；

20、tgcccgccgtgcccgnnknnktgc，翻译后为cppcpxxc；

21、tgcccgnnknnktgcccgccgtgc，翻译后为cpxxcppc；

22、tgcnnktgcccgnnknnktgc，翻译后为cxcpxxc；

23、tgcccgnnknnktgcnnktgc，翻译后为cpxxcxc；

24、tgcnnktgcnnktgc，翻译后为cxcxc；

25、tgcccgccgtgcccgccgtgc，翻译后为cppcppc；

26、tgcccgnnknnktgcccgnnknnktgc，翻译后为cpxxcpxxc；

27、其中，利用密码子简并性，tgc可用tgt代替，ccg可用ccc、cca、cct代替，nnk指通过nnk简并密码子编码随机氨基酸x，nnk密码子中的n代表a、t、c和g，k代表g和t；也可用其他随机氨基酸编码方式代替(如trimer、iubcode等)方式编码随机氨基酸x；

28、b、生物展示文库的构建：将a中所述dna核酸片段用于质粒重组，构建生物展示文库；所述生物展示文库包括多种展示系统：噬菌体表面展示肽库、酵母菌展示肽库、细菌表面展示肽库等；利用生物体自身的表达机制，将环肽呈现在细胞表面；

29、c、体外展示文库的构建：将a中所述dna核酸片段用于构建体外展示文库，体外展示文库包括mrna展示多肽文库、核糖体展示多肽文库等；用体外转录和翻译系统，将环肽呈现在mrna或核糖体上；

30、d、化学环肽文库的合成：使用固相合成法合成含有串联基序的化学环肽文库等；通过化学合成，控制环肽的序列和结构；

31、以下以两种四元环肽骨架为例进行说明。

32、构建cppcxcxmcxncxocppcxc形式的噬菌体四元环肽文库，其中，m/n/o＝5/5/5,3/5/7和3/7/5；具体的，展示在噬菌体表面多肽序列为：

33、cppcxcxxxxxcxxxxxcxxxxxcppcxc

34、cppcxcxxxcxxxxxcxxxxxxxcppcxc

35、cppcxcxxxcxxxxxxxcxxxxxcppcxc

36、其中，x表示随机氨基酸，通过nnk方式编码，在指定的位置引入氨基酸随机突变。得到展示该多肽的m13噬菌体展示文库ran-cppcxc，文库多样性为1.0×109。

37、展示在噬菌体表面多肽序列为：

38、cpxxcxcxxxxxcxxxxxxxxxxxcxcpxxc

39、其中，x表示随机氨基酸，通过nnk方式编码，在指定的位置引入氨基酸随机突变。得到展示该多肽的m13噬菌体展示文库ran-cpxxcxc，文库多样性为5.5×108。该文库固定7个半胱氨酸，第8个半胱氨酸通过nnk编码随机生成，包含22种四元环肽骨架，翻译修饰后可得到融合表达四元环ddmp的噬菌体。

40、(3)筛选和鉴定

41、将构建好的定向二硫键多环肽文库用于筛选靶标蛋白的活性多肽序列；

42、将ran-cppcxc三骨架噬菌体环肽文库针对keap1、epha2和her3靶点进行筛选，ran-cpxxcxc多骨架噬菌体环肽文库针对icos靶点进行筛选，使用avi tag生物素化蛋白固定在磁珠上，经过3轮和4轮筛选后，随机选取富集的噬菌体克隆进行测序。

43、本领域技术人员可以理解，靶蛋白的选则是大的和可变的。他们可以是例如人类或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的酶辅助因子或dna结合蛋白。适合的靶蛋白包括但不限于keap1、her3、epha2、icos等。以上靶蛋白不是穷举的。

44、根据测序后得到的富集多肽序列合成多肽，包括靶向keap1的多肽、靶向epha2的多肽、靶向her3的多肽、靶向icos的多肽；使用固相多肽合成多肽后进行氧化反应，氧化后得到的四元环肽命名后缀“-ox”(如h1氧化后产物为h1-ox)。使用荧光偏振法或表面等离子共振法测试各四元环肽与靶标蛋白的亲和力，以测试筛选结果的有效性。

45、使用e1、h2、h3、i1活性序列作为多肽模板，部分随机化多肽序列，构建噬菌体次级文库sce-epha2、sec-her3、tri-her3和sec-icos，分别针对keap1、epha2和her3靶点进行筛选，获得亲和力更好的靶向epha2的ddmp、靶向her3的ddmp、靶向icos的ddmp。使用表面等离子共振法测试各四元环肽与靶标蛋白的亲和力，测试筛选结果有效性。使用nmr法测定h2’-ox和i2’-ox的结构及二硫键配对，说明该方法能有效提供全新结构的ddmp分子。

46、(4)应用

47、使用固相多肽合成多肽后进行氧化反应，合成fitc标记的四元环肽f-h4-ox、f-i2-ox。使用dss与f-i2-ox偶联反应得到了f-i2-ox二聚体di-f-i2-ox。使用融合表达mcherry的靶蛋白(分别为her3和icos)质粒构建的瞬转hk293t细胞系，测试f-h4-ox、f-i2-ox、di-f-i2-ox与靶蛋白在细胞表面的荧光共定位。使用流式细胞术测定f-i2-ox、di-f-i2-ox在icos过表达的癌细胞hut-78上的亲和力，以说明亲和ddmp能用作细胞表面靶蛋白的检测探针分子。

48、本发明开发一组可用于制导多肽二硫键配对的串联基序，并提供将其用于设计二硫键精准配对的多元环肽骨架和构建富含二硫键环肽展示文库的方法。该方法进一步拓展多环肽文库的模板骨架多样性，有助于筛选靶向多种蛋白的功能性环肽配体和药物。本发明中所有串联基序均可用于设计高效氧化折叠的多元环肽模板并可以应用于生物体内表达技术和体外表达技术，可以实现多种多元环肽文库构建，用于筛选功能性环肽配体和药物。

49、本发明提供耐受序列修改的四元环肽模板，实现四元环肽分子内四对二硫键的精准配对。结合噬菌体展示技术，将四元环肽模板融合表达与噬菌体表面，构建噬菌体四元环肽库，充分说明串联基序制导多元环肽法与生物展示技术间具有良好相容性。

50、与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：

51、a.本发明所构建的环肽分子骨架合成方法简单，只需要常规的固相合成即可实现。

52、b.本发明解决富含二硫键的四元环肽折叠过程中的产物复杂不可控的问题，通过引入串联基序，利用串联基序制导多元环肽配对的能力，实现四元环肽氧化后仅产生较少异构体(一至两种)。

53、c.本发明与之前利用非天然氨基酸插入去调控巯基配对的技术相比，涉及到的都是天然氨基酸，适合生物体内合成的环肽文库设计。

技术特征：

1.一组串联基序，其特征在于分别为cppcxc、cxcppc、cppcpxxc、cpxxcppc、cxcpxxc、cpxxcxc、cxcxc、cppcppc和cpxxcpxxc；其中，c代表半胱氨酸，p代表脯氨酸、x代表任意氨基酸；

2.如权利要求1所述一组串联基序，其特征在于所述串联基序cppcxc、cxcppc、cppcpxxc、cpxxcppc、cppcppc和cxcxc具有平行配对倾向，驱动多肽二硫键交换反应向串联基序平行配对的方向进行，且耐受不同数量和位置的基序内氨基酸突变。

3.如权利要求1所述一组串联基序，其特征在于所述串联基序cpxxcxc、cxcpxxc和cpxxcpxxc具有反平行配对倾向，用以驱动多肽产生稳定的平行配对异构体和反平行配对异构体，且基序内可突变氨基酸数目不一致。

4.如权利要求1所述一组串联基序用于构建定向二硫键多环肽文库和发现多环肽配体的方法，其特征在于包括以下步骤：

5.如权利要求4所述一组串联基序用于构建定向二硫键多环肽文库和发现多环肽配体的方法，其特征在于在步骤(3)中，所述靶标蛋白包括但不限于keap1、her3、epha2、icos。

6.如权利要求4所述方法筛选的多环肽配体作为探针在化学生物学研究中的应用。

7.如权利要求4所述方法筛选的多环肽配体作为药物前体在药物制备中的应用。

8.如权利要求6或7所述应用，其特征在于通过化学修饰或生物修饰方法，对定向二硫键多环肽配体的n端、c端、环化方式、氨基酸序列进行改造，或通过非天然氨基酸替换手段将串联基序整体或部分破坏，最终作为化学生物学的研究工具及潜在治疗性药物设计的前体分子。

9.如权利要求1所述一组串联基序在筛选靶向多种蛋白的功能性环肽配体和药物中的应用。

技术总结
串联基序用于构建定向二硫键多环肽文库和发现多环肽配体，涉及环肽类化合物。定向二硫键多环肽是一类特殊的富含二硫键多肽，通过二硫键定向制导基序获得稳定的多元环构象，并能与多种靶标高亲和力结合，能作为药物设计的前体。为拓展多元环肽骨架和结构多样性，设计一组具有新颖制导二硫键折叠性质的二硫键定向制导基序，称为串联基序。将两个不同串联基序插入多肽序列中，能有效调控肽链二硫键配对及多肽折叠。通过在肽链中插入不同串联基序，实现构筑四元环拓扑结构的DDMP骨架。该骨架无需借用天然富含二硫键多肽的氧化折叠模板，可用于直接构建全随机化的多肽生物展示文库，并用于从头设计具有新结构和新功能的多元环肽配体和治疗性药物。

技术研发人员：吴川六,段曾平,孔垂莲,范诗卉
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5