HPLC法分离测定非奈利酮中间体Z2中杂质的方法与流程

本发明属于药物分析，具体涉及一种hplc法分离测定非奈利酮中间体z2中杂质的方法。

背景技术：

1、非奈利酮(finerenone，bay94-8862)作为一种非甾体类、选择性盐皮质激素受体拮抗剂，对糖尿病肾病具有心肾双重保护作用。非奈利酮通过阻断盐皮质激素受体(mr)的过度激活，减少炎症和纤维化过程，从而保护肾脏和心脏功能。该药物在治疗与2型糖尿病相关的慢性肾脏病方面展现出了良好的疗效和安全性。为确保药品安全性和有效性，需要在药品研发的每个阶段严格控制杂质含量，以确保最终产品的质量和安全。

2、非奈利酮中间体z2是非奈利酮合成过程中的关键中间体，研究并控制其杂质含量对提高非奈利酮药品质量具有重要意义。经研究发现，非奈利酮中间体z2中可能存在如下几种杂质：杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z2、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b、杂质sm3、杂质sm3a、杂质z2c；其结构式依次如式ⅰ-式ⅺ所示。这些杂质会影响非奈利酮中间体z2的质量，进而影响非奈利酮制剂产品的品质。然而目前未见现有文献或专利资料对非奈利酮中间体z2及其有关杂质的分析方法进行报道。

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5、现有技术对非奈利酮及其相关物质的分析方法报道较少。查询到cn117630224a专利公开了一种hplc分离测定非奈利酮对映异构体的方法，其以硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂，以低级烷烃为流动相a、低级醇为流动相b，进行等度洗脱；并采用紫外检测器进行检测。然而该方法不能有效分离检测非奈利酮中间体z2及其有关杂质。

6、因此，需要建立新的方法来检测非奈利酮中间体z2及其有关杂质，以提高非奈利酮中间体z2及非奈利酮制剂产品的质量。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种采用hplc方法分离非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，该方法可以在60分钟内或大于60分钟的时间实现非奈利酮中间体z2及其杂质的有效分离。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、采用hplc方法分离非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，包括如下步骤：

4、(1)配制待测样品溶液；所述待测样品溶液包含非奈利酮中间体z2及其杂质；所述杂质包括杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b中的任一种或多种；

5、(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂，以三氟乙酸水溶液为流动相a，以有机溶剂为流动相b，通过梯度洗脱将待测样品中主成分非奈利酮中间体z2及其杂质进行分离；

6、所述非奈利酮中间体z2的结构式如式ⅰ所示，所述杂质z2a的结构式如式ⅱ所示，所述杂质sm1的结构式如式ⅲ所示，所述杂质z1c的结构式如式ⅳ所示，所述杂质z1的结构式如式ⅴ所示，所述杂质z2d的结构式如式ⅵ所示，所述杂质z2e的结构式如式ⅶ所示，所述杂质z2b的结构式如式ⅷ所示；

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9、进一步，所述待测样品为待测组合物；所述待测组合物包含非奈利酮中间体z2，有关物质，以及杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b中的任一种或多种；所述有关物质包括杂质sm3、杂质sm3a、杂质z2c中的任一种或多种；所述杂质sm3的结构式如式ⅸ所示，杂质sm3a的结构式如式ⅹ所示，杂质z2c的结构式如式ⅺ所示；

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11、进一步，可以利用所述方法对非奈利酮中间体z2及其有关物质中的杂质进行分离。

12、进一步，所述梯度洗脱的程序设置如下：

13、0min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为70-90:30-10；

14、3min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为70-90:30-10；

15、27min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为55-65:45-35；

16、45min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为30-50:70-50；

17、50min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为30-50:70-50；

18、50.1min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为70-90:30-10；

19、60min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为70-90:30-10。

20、作为优选，所述梯度洗脱程序设置如下：

21、0min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为78-82:22-18；

22、3min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为78-82:22-18；

23、27min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为62:38；

24、45min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为40:60；

25、50min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为40:60；

26、50.1min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为78-82:22-18；

27、60min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为78-82:22-18。

28、作为最优选，所述梯度洗脱程序设置如下：

29、0min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为80:20；

30、3min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为80:20；

31、27min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为62:38；

32、45min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为40:60；

33、50min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为40:60；

34、50.1min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为80:20；

35、60min，所述流动相a和所述流动相b的体积比为80:20。

36、进一步，所述三氟乙酸水溶液的浓度为0.05％-0.15％，优选为0.09％-0.11％，最优选为0.1％；所述有机溶剂为甲醇。

37、进一步，所述流动相的流速为0.8-1.5ml/min，优选为1.0ml/min-1.2ml/min，最优选为1.1ml/min；所述色谱柱的柱温为30℃-40℃，优选为33℃-37℃，最优选为35℃；进样器温度为3℃-7℃，优选为5℃。

38、作为优选，运行时间为60分钟。

39、作为优选，色谱柱规格为4.6mm×150mm 3μm，优先选择shim-pack fc-ods，4.6mm×150mm 3μm。

40、作为优选，进样体积为10μl。

41、作为优选，步骤(1)中，样品配制溶剂为浓度为50％的乙腈水溶液，由乙腈和水按体积比50:50配制而得。

42、作为优选，待测样品溶液的浓度为1mg/ml。

43、本发明的目的之二在于提供一种鉴别非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，该方法检测限低，可有效鉴别样品中浓度低至0.07-0.09μg/ml的杂质。

44、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

45、鉴别非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，采用前述方法将非奈利酮中间体z2及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；通过对比检测品与对照品的色谱行为来判断检测品中是否含有非奈利酮中间体z2及其杂质。

46、进一步，所述检测器的检测波长为240nm-280nm，优选为260nm。

47、进一步，以非奈利酮中间体z2为参照峰，相对保留时间为0.73±0.2的判断为杂质z2a，相对保留时间为0.84±0.2的判断为杂质sm1，相对保留时间为0.93±0.2的判断为杂质z1c，相对保留时间为1.17±0.2的判断为杂质z1，相对保留时间为1.21±0.2的判断为杂质z2d，相对保留时间为1.41±0.2的判断为杂质z2e，相对保留时间为1.46±0.2的判断为杂质z2b。

48、进一步，保留时间为27.3±0.5的判定为奈利酮中间体z2，保留时间为19.6±0.5的判断为杂质z2a，保留时间为22.4±0.5的判断为杂质sm1，保留时间为25.0±0.5的判断为杂质z1c，保留时间为31.4±0.5的判断为杂质z1，保留时间为32.6±0.5的判断为杂质z2d，保留时间为37.9±0.5的判断为杂质z2e，保留时间为39.3±0.5的判断为杂质z2b。

49、可以根据保留时间或相对保留时间对各组分进行定性。

50、本发明的目的之三在于提供一种测定非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，该方法定量限低，可有效检测样品中浓度低至0.2-0.3μg/ml的杂质含量。

51、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

52、测定非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，包括如下步骤：

53、(1)利用前述鉴别方法对非奈利酮中间体z2及其杂质进行分离和检测，得到色谱图；

54、(2)根据步骤(1)所得色谱图，以峰面积采用加校正因子的主成分自身对照法和/或外标法计算各杂质含量。

55、进一步，待测溶液除样品溶液之外，还包括对照溶液和系统适用性溶液。

56、作为优选，所述对照溶液的浓度为5μg/ml。

57、作为优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：

58、1.取乙腈和水按体积比50:50配制，得到溶剂；

59、2.取本品适量，精密称定，加溶剂超声使溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为样品溶液；

60、3.精密量取样品溶液适量，加溶剂定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为对照溶液；

61、4.取z2系统适用性对照品(含杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b)适量，加溶剂超声溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为系统适用性溶液；

62、5.取上述系统适用性溶液、样品溶液和对照溶液，依次注入液相色谱仪，按前述色谱条件进行检测，并得到色谱图；采用加校正因子的主成分自身对照法和/或外标法计算各杂质含量。

63、进一步，系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、z2、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b，各组分峰之间的分离度应符合要求。

64、进一步，采用加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量；所述杂质z2a的校正因子为1.2，所述杂质sm1的校正因子为0.58，所述杂质z1c的校正因子为1.5，所述杂质z1的校正因子为1.6，所述杂质z2b的校正因子为1.2，杂质z2d的校正因子为1.0，杂质z2e的校正因子为1.0。

65、进一步，若检测品中，杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z1、杂质z2b、杂质z2d和杂质z2e小于等于对照溶液主峰面积0.3倍(0.15％)，其他单个杂质峰面积小于等于对照溶液主峰面积(0.5％)，杂质总量不大于2.0％，表示检测品合格；反之，若检测品中，杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z1、杂质z2b、杂质z2d和杂质z2e大于对照溶液主峰面积0.3倍(0.15％)，或其他单个杂质峰面积大于对照溶液主峰面积(0.5％)，或杂质总量大于2.0％，表示检测品不合格。

66、本发明的有益效果在于：

67、1、用于分离非奈利酮中间体z2中杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z2、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b并测定其含量的方法，目前未见文献报道。本方法属于自建高效液相色谱法，该方法具有简单、快速、准确度高、耐用性好、重现性好等优点。

68、2、本方法在一套hplc方法实现了非奈利酮中间体z2中杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z2、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b共计7个杂质的有效分离，该方法专属性好，不受空白、已知杂质(如杂质sm3、杂质sm3a、杂质z2c等)和其他未知杂质干扰，已知杂质间分离度均大于2.0，符合有关物质要求。

69、3、本发明提供的非奈利酮中间体z2中7种杂质的hplc分析方法可在较短时间内同时实现非奈利酮中间体z2中7种杂质的分离，分离时间仅需60分钟。

70、4、本发明方法具有高灵敏度的特点，杂质z2a的定量限浓度低至0.246μg/ml，检测限浓度低至0.086μg/ml；杂质sm1的定量限浓度低至0.256μg/ml，检测限浓度低至0.089μg/ml；杂质z1c的定量限浓度低至0.231μg/ml，检测限浓度低至0.081μg/ml；杂质z2的定量限浓度低至0.202μg/ml，检测限浓度低至0.071μg/ml；杂质z1的定量限浓度低至0.251μg/ml，检测限浓度低至0.088μg/ml；杂质z2d的定量限浓度低至0.226μg/ml，检测限浓度低至0.079μg/ml；杂质z2e的定量限浓度低至0.246μg/ml，检测限浓度低至0.086μg/ml；杂质z2b的定量限浓度低至0.253μg/ml，检测限浓度低至0.089μg/ml。

技术特征：

1.采用hplc方法分离非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为待测组合物；所述待测组合物包含非奈利酮中间体z2，有关物质，以及杂质z2a、杂质sm1、杂质z1c、杂质z1、杂质z2d、杂质z2e、杂质z2b中的任一种或多种；所述有关物质包括杂质sm3、杂质sm3a、杂质z2c中的任一种或多种；所述杂质sm3的结构式如式ⅸ所示，杂质sm3a的结构式如式ⅹ所示，杂质z2c的结构式如式ⅺ所示；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序设置如下：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三氟乙酸水溶液的浓度为0.05％-0.15％；所述有机溶剂为甲醇。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8-1.5ml/min；所述色谱柱的柱温为30℃-40℃；进样器温度为3℃-7℃。

6.鉴别非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的方法将非奈利酮中间体z2及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；通过对比检测品与对照品的色谱行为来判断检测品中是否含有非奈利酮中间体z2及其杂质。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测器的检测波长为240nm-280nm。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以非奈利酮中间体z2为参照峰，相对保留时间为0.73±0.2的判断为杂质z2a，相对保留时间为0.84±0.2的判断为杂质sm1，相对保留时间为0.93±0.2的判断为杂质z1c，相对保留时间为1.17±0.2的判断为杂质z1，相对保留时间为1.21±0.2的判断为杂质z2d，相对保留时间为1.41±0.2的判断为杂质z2e，相对保留时间为1.46±0.2的判断为杂质z2b。

9.测定非奈利酮中间体z2及其杂质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量；所述杂质z2a的校正因子为1.2，所述杂质sm1的校正因子为0.58，所述杂质z1c的校正因子为1.5，所述杂质z1的校正因子为1.6，所述杂质z2b的校正因子为1.2，杂质z2d的校正因子为1.0，杂质z2e的校正因子为1.0。

技术总结
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种HPLC法分离测定非奈利酮中间体Z<subgt;2</subgt;中杂质的方法。杂质为杂质Z<subgt;2a</subgt;、杂质SM<subgt;1</subgt;、杂质Z<subgt;1c</subgt;、杂质Z<subgt;1</subgt;、杂质Z<subgt;2d</subgt;、杂质Z<subgt;2e</subgt;、杂质Z<subgt;2b</subgt;中的任一种或多种。该方法是采用十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂，以三氟乙酸水溶液为流动相A，有机溶剂为流动相B，通过梯度洗脱将待测样品中主成分非奈利酮中间体Z<subgt;2</subgt;及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；采用加校正因子的主成分自身对照法和/或外标法计算各杂质含量。本发明方法成功实现了非奈利酮中间体Z<subgt;2</subgt;中7种杂质的同时分离和测定，检测方法灵敏度高，实用性强，结果准确可靠，对于非奈利酮的Z<subgt;2</subgt;质量控制具有重要的意义。

技术研发人员：王海燕,杨婧,廖唯乔
受保护的技术使用者：重庆华邦制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5