一种蜈蚣特征标志物及其应用的制作方法
本发明涉及蜈蚣药材的鉴别方法，具体涉及一种蜈蚣特征标志物及其应用。
背景技术：
1、蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣scolopendra subspinipes mutilans l.koch的干燥体，是我国传统动物中药材之一，含有多种氨基酸、小分子肽、甾醇等活性物质，具有祛风、定惊、攻毒、散结等功能，被广泛应用于中医临床。浙江岱山蜈蚣作为道地药材，多数为野生，因其头部金黄色，足红色，具油漆样光泽，俗称：“金头蜈蚣”，远销东南亚地区，其质量明显优于其他产地蜈蚣。随着蜈蚣药材市场价格的不断走高，以次充好、掺伪情况等日益严重。多棘巨蜈蚣是近年来发现的一种蜈蚣伪品，为蜈蚣科动物多棘巨蜈蚣s.subspinipesmultidens newport的干燥体，其形体较少棘巨蜈蚣大只，二者主要形态区别在于多棘巨蜈蚣尾足的前股节背面内侧棘数、腹面外侧棘数、腹面内侧棘数均较少棘蜈蚣为多；颚肢齿板的齿数亦多。在二者形态完整的前提下，可基于以上特征进行鉴别。然而，形态鉴别依赖鉴定者的经验和技能，蜈蚣药材在加工炮制及运输过程中其形态如头、步足、尾棘等主要特征易脱落，且通常以蜈蚣段、蜈蚣粉及成药等形式入药，仅靠传统方法鉴别较难获得正确的结果。因此，需要建立一种准确、高效的鉴别方法来区分正品少棘巨蜈蚣和混伪品种多棘巨蜈蚣，以保障中药材市场的健康发展。
2、随着生物技术的发展，基于肽段的鉴别技术逐渐崭露头角。特征肽段是蛋白质中具有特定序列的肽链片段，具有高度的特异性和稳定性。在中药材鉴别领域，基于特征肽段的鉴别方法不仅可以提高鉴别的准确性，还能有效地区分近似种类。程显隆等采用特征肽段检测技术用于胶类药材的专属性鉴别方法研究；刘宇文等分别找到龟甲及巴西龟的特征肽段，用于龟甲中掺巴西龟的检查研究。已有研究使用dna条形码、特异性pcr技术进行蜈蚣及其混伪品种的鉴别，但基于特征肽识别技术用于蜈蚣药材专属性鉴别方法及道地性研究未见系统报道。
3、为此，本发明旨在提供一种蜈蚣特征标志物及其应用，以解决上述问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种蜈蚣特征标志物及其应用，通过lc-qtof多肽识别技术找到适用于蜈蚣药材鉴定的特征肽段及特征代谢产物，利用pca、t检验和方差分析、火山图分析等化学计量学方法，筛选少棘巨蜈蚣和多棘巨蜈蚣以及不同产地少棘巨蜈蚣的特征标志物，基于特征性mark建立超高效液相色谱-三重串联四级杆质谱联用(uplc-qqq)法，优化特征离子的质荷比(母离子、子离子)和质谱条件，以多反应监测模式(mrm)，区分药典品种少棘巨蜈蚣、混伪品种多棘巨蜈蚣以及道地产区少棘巨蜈蚣，为蜈蚣药材真伪鉴别及道地性研究提供思路及方法。
2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
3、本发明提供了一种蜈蚣特征标志物及其应用，所述特征标志物包含3个特征肽段和1个特征性代谢产物，所述特征肽段为m/z615.2、m/z477.3、m/z845.9和特征性代谢产物m/z301.2。通过采用胰蛋白酶对蜈蚣样本进行酶解处理，利用uhplc-qtof-ms超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法和massprofilerprofessional化学计量学统计分析功能，筛选出4个特征性mark，所述4个特征性mark包含3个特征肽段和1个特征性代谢产物，并通过peaks studio蛋白组学软件及sirius 5.6.3软件基于小分子化合物数据库信息检索，得到3个蜈蚣特征肽段及1个特征性代谢产物；基于上述4个特征性mark，建立超高效液相色谱-三重串联四级杆质谱uhplc-qqq用于蜈蚣特征肽的专属性鉴别方法。
4、与现有技术相比，本方案的有益效果：
5、基于lc-qtof技术结合化学计量学进行统计分析，筛选得到适用于蜈蚣及其混伪品种的真伪鉴别以及道地蜈蚣药材追溯的4个特征标志物。建立了超高效液相色谱一三重串联四级杆质谱联用(uhplc-qqq)法用于蜈蚣的专属性鉴别研究；通过特征肽段m/z615.2、m/z477.3、m/z845.9和特征代谢产物m/z301.2存在的差异，可以实现药典品种少棘巨蜈蚣与多棘巨蜈蚣的真伪鉴别，以及道地产区少棘巨蜈蚣的追溯；该方法专属性好，灵敏度高，不仅可用于蜈蚣中药材的真伪鉴别，对于含蜈蚣的成药或者动物药材的质量评价方法的开发也具有借鉴意义；通过对特征肽段的氨基酸序列进行确证，并以此为基础，后期可建立定量方法，包含专属性肽段的序列、特征图谱、含量指标的蜈蚣特征肽智能识别信息库，为下一步蜈蚣药材道地性研究及相关制剂的质量控制和评价提供思路。
技术特征：
1.一种蜈蚣特征标志物，其特征是：所述标志物包含3个特征肽段和1个特征性代谢产物，所述特征肽段为m/z615.2、m/z477.3、m/z845.9和特征性代谢产物m/z301.2。
2.如权利要求1所述的一种蜈蚣特征标志物的鉴定方法，其特征是：采用胰蛋白酶对蜈蚣样本进行酶解处理，利用uhplc-qtof-ms超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法和massprofiler professional化学计量学统计分析功能，筛选出4个特征性mark，所述4个特征性mark包含3个特征肽段和1个特征性代谢产物，并通过peaks studio蛋白组学软件及sirius5.6.3软件基于小分子化合物数据库信息检索，得到3个蜈蚣特征肽段及1个特征性代谢产物；基于上述4个特征性mark，建立超高效液相色谱-三重串联四级杆质谱uhplc-qqq用于蜈蚣特征肽的专属性鉴别方法。
技术总结
本发明公开了一种蜈蚣特征标志物及其应用，涉及蜈蚣药材的鉴别方法技术领域，其技术要点为：基于LC‑QTOF多肽识别技术结合化学计量学，筛选蜈蚣及其混伪品种的特征标志物，建立专属性鉴别方法：采用胰蛋白酶对蜈蚣进行酶解处理，利用(UHPLC‑QTOF‑MS)超高效液相色谱‑四极杆飞行时间质谱法和Mass Profiler Professional(MPP)化学计量学统计分析功能，筛选出4个特征性MARK，并通过PEAKS Studio蛋白组学软件及SIRIUS 5.6.3软件基于小分子化合物数据库信息检索；基于4个特征性MARK，建立超高效液相色谱‑三重串联四级杆质谱(UHPLC‑QQQ)用于蜈蚣及其混伪品的专属性鉴别方法。该方法重复性好，操作简便，可快速鉴别少棘巨蜈蚣及其混伪品，为蜈蚣质量评价及道地性研究提供思路。
技术研发人员：吴纤愫,王恒,周勇,李彬,吴益春,张梦奇,石婧,张红萍,徐虹,倪东宇,张玲,马梦营
受保护的技术使用者：舟山市食品药品检验检测研究院（国家海洋食品质量监督检验中心、浙江省海洋水产品质量检测中心、舟山市医疗器械质量监督检验所、舟山市药品不良反应监测中心、舟山市渔业检验检测中心、舟山市农产品质量检测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5