一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法及应用
本发明涉及生物材料制备，具体是涉及一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法及应用。
背景技术：
1、皮肤作为人体的第一道屏障，在抵御外力、机体免疫、感受调节、物理或化学刺激缓冲、防止营养和电解质流失等方面起着不可或缺的作用。然而，皮肤是最容易受到伤害的，包括烧伤、擦伤、撕裂、挫伤、临床外科手术或其他表面损伤。此外，糖尿病伤口具有复杂的微环境，表现为高血糖、enos的活性受到影响、细菌反复感染、细胞因子和生长因子表达紊乱、蛋白酶活性增加、炎症持续性、血管生成和组织再生受损。所有这些因素都会阻碍愈合过程，延长伤口愈合的四个重叠阶段中的一个或多个，这增加了临床糖尿病创面治疗的难度。no能有效抑制炎症、促进血管新生、促进巨噬细胞极化和破坏细菌膜通透性。因此，设计一种可有效递送no、可促进耐药菌感染糖尿病伤口愈合、生物相容性优异的多功能抗菌纳米递送系统具有重要的临床意义。
2、no已被证明通过调节炎症和血管生成来加速急性或慢性伤口的愈合，然而，在大多数情况下，由于伤口微环境中缺乏no，内源性no几乎无法满足治疗应用的需求。对糖尿病伤口进行外源性no的直接方法是气态给药，但这无疑会增加治疗成本，并且需要复杂的设备，实现no的靶向和控制释放仍然是一个亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，提供一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法及应用，本技术方案解决了上述背景技术中提出的由于伤口微环境中缺乏no，内源性no几乎无法满足治疗应用的需求。对糖尿病伤口进行外源性no的直接方法是气态给药，但这无疑会增加治疗成本，并且需要复杂的设备的问题。
2、为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：
3、一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，包括：
4、s1、将mb前药与靶向细菌的苯硼酸修饰聚乙二醇-聚赖氨酸，成功构建pel-pba-mb；
5、s2、将pel-pba-mb溶于no前药parg水溶液中，通过亲疏水自组装成pel-pba-mb/parg囊泡；
6、s3、对金纳米棒进行表面修饰，使其表面带有负电荷，通过静电相互作用将带负电荷的au-纳米棒吸附在带正电荷的pel-pba-mb/parg囊泡表面，形成no前药parg与光热au纳米棒共同递送的au/pel-pba-mb/parg纳米药物。
7、优选的，所述将mb前药与靶向细菌的苯硼酸修饰聚乙二醇-聚赖氨酸，成功构建pel-pba-mb具体包括以下步骤：光敏剂mb-nc的制备、亲水聚合物pel的制备和pel-pba-mb的制备。
8、优选的，所述光敏剂mb-nc的制备具体包括以下步骤：
9、在mb溶液中加入甲苯，氮气气氛，在50℃搅拌下加入二硫化钠，再加入无水碳酸钠，搅拌15min后，将甲苯相转移到含有无水硫酸钠的排氮烧瓶中，在氮气气氛下干燥，得到液体；
10、将液体与4-硝基苯氯甲酸酯甲苯溶液搅拌冰浴，后加入tea，25℃反应12h，将有机相干燥，减压蒸发，在乙腈中重结晶2次，得到mb-np固体晶体。
11、将mb-np固体晶体溶解于无水thf中，并加入乙醇胺和tea，反应避光，60℃下回流24h，减压蒸发后，进行柱层析分离，洗脱后的溶液在减压下蒸发，得到mb-ea粉末；
12、将mb-ea粉末与4-硝基苯氯甲酸酯冰浴30min后，室温反应8h，减压蒸发后，进行柱层析分离，洗脱后的溶液在减压下蒸发，得到mb-nc粉末。
13、优选的，所述亲水聚合物pel的制备具体包括以下步骤：
14、将h-lys(z)-oh溶液，加入三光气在50℃n2气氛下搅拌3h，将所得溶液倒入过量的正己烷中，得到z-lys-nca；
15、将氨基端聚乙二醇溶解在dmf中，于50℃，n2气氛下聚合三天，混合物在过量的乙醚中沉淀三次，得到pel(z)；
16、将pel(z)在冰浴中溶于tfa，搅拌15min后，滴加hbr，再搅拌1h，然后在乙醚中沉淀，溶液在蒸馏水中透析3天，再进行冻干得到pel。
17、优选的，所述pel-pba-mb的制备具体包括以下步骤：
18、将pel与tea溶于无水dcm中，将mb-nc粉末滴入溶液中，室温下搅拌12h，反应混合物在乙醚中沉淀，沉淀物在乙酸乙酯中重结晶，随后在减压下干燥，得到a8；
19、将4-羧基苯基硼酸溶于dmso与edc和nhs反应30min后，加入a8，37℃搅拌12h，最后经蒸馏水透析48h，得到pel-pba-mb。
20、优选的，所述将pel-pba-mb溶于no前药parg水溶液中，通过亲疏水自组装成pel-pba-mb/parg囊泡具体包括以下步骤：
21、将pel-pba-mb溶于乙腈中，在25℃下搅拌24h，将溶液滴加到溶解了no前药parg的去离子水中，8000rpm离心10min，得到pel-pba-mb/parg囊泡
22、优选的，所述形成no前药parg与光热au纳米棒共同递送的au/pel-pba-mb/parg纳米药物具体包括以下步骤：
23、将haucl4和ctab混合，加入agno3，后用hcl调节ph至1.15，然后加入抗坏血酸，轻轻摇晃，使溶液由黄色变为无色，立即注入nabh4冰溶液，反应6h，aunrs用去离子水洗涤2次，得到au@ctab；
24、在au@ctab加入硼氢化钠水溶液，孵育1h，然后在乙醇中加入11-巯基癸酸溶液孵育12h，得到au@mua；
25、pel-pba-mb/parg囊泡用超纯水重悬，将au@mua与pel-pba-mb/parg囊泡重悬，200rpm振荡反应12h，9000rpm离心15min，沉淀重悬于pbs中，得到au/pel-pba-mb/parg囊泡溶液。
26、进一步的，本技术提供的所述的方法制备的驼胶抗菌纳米递送系统。
27、进一步的，所述的驼胶抗菌纳米递送系统在医疗抗菌糖尿病伤口愈合中的应用。
28、与现有技术相比，本发明提供了一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法及应用，具备以下有益效果：
29、1.此发明制备的多功能纳米递送系统具有极佳的细菌捕获能力和抗菌性能。苯硼酸修饰的纳米囊泡通过no抗菌策略与光热抗菌策略协同展现出持久的抗菌能力和最小化的机体损伤。经体外抗菌实验验证对mrsa和e.coli均有显著的抗菌效果(>99％)。
30、2.此发明制备的多功能纳米递送系统能有效地促进细胞迁移、增殖和成管。经过细胞的迁移、增殖和成管实验结果表明，纳米囊泡能有效可控释放no，促进细胞迁移、增殖和成管。
31、3.此发明制备的多功能纳米递送系统能有效促进糖尿病伤口愈合。经囊泡治疗mrsa感染后的伤口愈合周期明显缩短，皮肤愈合结果表明囊泡可以免疫调节巨噬细胞从促炎的m1向抗炎的m2型巨噬细胞极化，降低糖尿病伤口中耐药菌感染的炎症，通过促进伤口闭合、胶原沉积和血管新生，极大地加速耐药菌感染的糖尿病伤口愈合。
32、4.本发明制备的多功能纳米递送系统具有良好的生物相容性。经过体外细胞毒性实验和荧光染色证实此囊泡细胞相容性好，对人体皮肤组织无刺激性，符合机体运用条件。
33、5.本发明制备的多功能纳米递送系统适用糖尿病感染创面以及组织再生辅助材料等。动物实验证实在无药物或细胞因子传递的情况下能明显加速细菌感染伤口愈合。
技术特征：
1.一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述将mb前药与靶向细菌的苯硼酸修饰聚乙二醇-聚赖氨酸，成功构建pel-pba-mb具体包括以下步骤：光敏剂mb-nc的制备、亲水聚合物pel的制备和pel-pba-mb的制备。
3.根据权利要求2所述的一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述光敏剂mb-nc的制备具体包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述亲水聚合物pel的制备具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述pel-pba-mb的制备具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述将pel-pba-mb溶于no前药parg水溶液中，通过亲疏水自组装成pel-pba-mb/parg囊泡具体包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述形成no前药parg与光热au纳米棒共同递送的au/pel-pba-mb/parg纳米药物具体包括以下步骤：
8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备的抗菌纳米递送系统。
9.权利要求8所述的抗菌纳米递送系统用于医疗抗菌糖尿病伤口愈合。
技术总结
本发明公开了一种多功能抗菌纳米递送系统的制备方法及应用，包括将MB前药与靶向细菌的苯硼酸修饰聚乙二醇‑聚赖氨酸，成功构建PEL‑PBA‑MB；将PEL‑PBA‑MB溶于NO前药PArg水溶液中，通过亲疏水自组装成PEL‑PBA‑MB/PArg囊泡；形成NO前药PArg与光热Au纳米棒共同递送的Au/PEL‑PBA‑MB/PArg纳米药物。此发明制备的多功能纳米递送系统具有极佳的细菌捕获能力和抗菌性能。苯硼酸修饰的纳米囊泡通过NO抗菌策略与光热抗菌策略协同展现出持久的抗菌能力和最小化的机体损伤。经体外抗菌实验验证对MRSA和E.coli均有显著的抗菌效果，且纳米囊泡能有效可控释放NO，促进细胞迁移、增殖和成管，降低糖尿病伤口中耐药菌感染的炎症，通过促进伤口闭合、胶原沉积和血管新生，加速耐药菌感染的糖尿病伤口愈合。
技术研发人员：张计青,刘玉林
受保护的技术使用者：山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5