一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法

：本发明涉及多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法领域，尤其涉及一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法。

背景技术

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背景技术：

1、雄蚕蛾是雄性家蚕的成虫阶段，一种属于蛾类的昆虫。含有粗脂肪、粗蛋白质等成分，蚕蛾蛋白具有延缓衰老、增强免疫力等功效。据报道，雄蚕蛾目前的应用主要是蚕蛾酒，蚕蛾的利用率不高，市场认可度不高，对雄蚕蛾的组成尚未进行充分研究，资源利用率低，部分人食用后会出现过敏，因此，通过酶解技术将雄蚕蛾蛋白解成小的生物活性肽或氨基酸，以解决过敏问题。锌对于我们人类发育是不可或缺的矿物质，它的摄入量远超过其它任何微量元素。主要以离子形式存在于人体中，作为许多酶的辅因子参与了许多生物化学反应。通过将锌元素与肽链结合，形成稳定的螯合物，进一步提高了锌的生物利用率和安全性。在这个过程中，锌离子可以与肽中的个别残基形成配位键，锌螯合肽是指具有锌螯合能力的生物活性肽与锌离子结合形成的较稳定的螯合物。

2、为此，我们提出一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明主要是解决上述现有技术对人体必需的锌离子难吸收及雄蚕蛾营养价值高的蛋白利用率低的问题，提供了一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下方案，包括下述步骤：

3、步骤一：新鲜雄蚕蛾的处理及超声脱脂；

4、步骤二：碱性蛋白酶降解雄蚕蛾多肽；

5、步骤三：雄蚕蛾多肽螯合锌的制备；

6、步骤四：雄蚕蛾多肽螯合锌微射流纳米均质处理；

7、步骤五：雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉的制备。

8、步骤六：雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉氨基酸成分分析。

9、步骤七：雄蚕蛾多肽纳米螯合锌的吸收与转运。

10、步骤八：细胞毒性分析。

11、步骤九：不同锌源对caco-2细胞锌转运蛋白表达的影响。

12、雄蚕蛾超声脱脂的方法，取刚羽化的雄蚕蛾30只，去翅后清洗沥干，烘干，干燥法测含水量。打磨成粉末状。以正己烷为溶剂，设置超声条件，干燥后得到雄蚕蛾脱脂蛋白粉末以备酶解实验使用。

13、使用碱性蛋白酶降解雄蚕蛾多肽，将雄蚕蛾蛋白与去离子水相溶，称取一定的蛋白酶，在一定的温度和ph下酶解一定的时间。酶解结束后灭酶，静置冷却，离心15min，取上清液,冷冻干燥，以备后续实验使用。

14、雄蚕蛾多肽螯合锌的方法，雄蚕蛾多肽粉溶解于蒸馏水，与硫酸锌溶液混合，雄蚕蛾多肽浓度为2.5mg/ml，锌离子浓度为5mmol/l，使用0.05mol/lnaoh和0.05mol/lhcl调节反应体系ph值为7.0，在40℃下，恒温水浴摇床中进行螯合反应，反应时间为30min。将雄蚕蛾蛋白溶于100ml去离子水中打浆，制备雄蚕蛾多肽螯合锌乳浆于﹣20℃冷冻储藏备用。

15、将雄蚕蛾多肽螯合锌乳浆放入微射流均质机进行纳米均质处理，获取均一的雄蚕蛾多肽纳米螯合锌乳浆。

16、雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉的冷冻干燥，乳浆料液冷冻干燥，设置冷冻干燥机温度，抽真空。冻干过程中，可对干燥箱内的压力进行控制，提高冰晶的升华速率。设置冻干箱内的压力，当干燥箱内的真空度降至20pa时，开始对搁板进行加热，搁板加热时温度应始终保持＜﹣18℃。在升温过程中，保持6℃/h的升温速率。得含水量10％以下雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉。得含水量10％以下雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉。

17、雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉氨基酸成分分析，将处理后的雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉和雄蚕蛾多肽粉在蒸馏水中溶解，用自动氨基酸分析仪检测。用分离柱分离雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉样品中的氨基酸，然后在反应柱上进行分析。

18、雄蚕蛾多肽纳米螯合锌的吸收与转运检测，caco-2细胞在24孔的transwell培养板上培养，弃掉培养基，37℃下培养2h，用4％的十二烷基硫酸钠收割细胞，将收割好的细胞做好保存。计算收割率。

19、细胞毒性分析，将雄蚕蛾多肽纳米螯合锌进行caco-2细胞毒性测试，按顺序依次添加100μl梯度浓度的雄蚕蛾多肽纳米螯合锌培养液处理细胞。

20、不同浓度雄蚕蛾纳米多肽螯合锌对细胞活力的影响，选取硫酸锌，氧化锌，雄蚕蛾多肽纳米螯合锌等三种不同锌源，用三种不同的锌转运蛋白试剂盒znt-6进行试验，观察caco-2细胞中锌转运蛋白表达量的关系。

21、有益效果：

22、提供一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，使之克服现有技术的不足，通过创新的螯合技术，充分发挥雄蚕蛾蛋白和锌离子的效果，并具有方法简单，工艺可控易于生产等特点。

技术特征：

1.一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，其特征在于，依照下述步骤：

2.如要求1所述的一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，其特征在于，雄蚕蛾超声脱脂的方法，包括以下步骤：

3.如要求1所述的一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，其特征在于，使用碱性蛋白酶降解雄蚕蛾多肽，将雄蚕蛾蛋白与去离子水相溶，称取一定的蛋白酶，在一定的温度和ph下酶解一定的时间。酶解结束后灭酶，静置冷却，离心15min，取上清液,冷冻干燥，以备后续实验使用。包括以下步骤：

4.如要求1所述的一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，其特征在于，一种雄蚕蛾多肽螯合锌的方法，包括以下步骤：

5.如要求1所述的一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，其特征在于，雄蚕蛾多肽螯合锌微射流纳米均质处理，包括以下步骤：

6.如要求1所述的一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，其特征在于，冷冻干燥，包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法领域，且公开了一种雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉制备方法，包括以下步骤：一：新鲜雄蚕蛾的处理及超声脱脂；二：碱性蛋白酶降解雄蚕蛾多肽；三：雄蚕蛾多肽螯合锌的制备；四；雄蚕蛾多肽螯合锌微射流纳米均质处理；五：雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉的制备。六：雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉氨基酸成分分析。七：雄蚕蛾多肽纳米螯合锌的吸收与转运。八：细胞毒性分析。九：不同锌源对Caco‑2细胞锌转运蛋白表达的影响。结果表明Caco‑2细胞对雄蚕蛾多肽纳米螯合锌吸收效果更好。本发明中，雄蚕蛾多肽纳米螯合锌冻干粉，根据发明步骤，预期结果，与未螯合的锌相比，螯合锌吸收率更高，雄蚕蛾多肽利用率更高。

技术研发人员：孙尧,郭梦青,董宁,马睿,李深
受保护的技术使用者：长春工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5