荧光标记的鼻内递送的制作方法

本发明涉及用于诊断cns疾病的荧光标记。

背景技术：

1、视网膜评估可以提供关于许多系统性疾病的存在和严重性的信息。例如，凋亡的视网膜细胞的检测(darc)描述了一种监测视网膜细胞死亡速率的技术，最近完成了诊断青光眼的i期临床试验(科尔迪罗等，2017年)，目前正在一系列神经退行性疾病进行中的ii期临床试验，包括青光眼、与年龄有关的黄斑变性、视神经炎和唐氏病(作为阿尔茨海默氏病的模型)。该技术目前包括静脉内施用一种称为anx776的新型荧光剂，新型荧光剂包含内源蛋白annexin a5的改良版，其与近红外荧光团dy-776荧光结合(科尔迪罗等，2017)。

2、darc利用眼睛的独特光学特性，可以使用荧光标记的人膜联蛋白v衍生物直接观察患者的单神经细胞凋亡。膜联蛋白v是一种人蛋白，其具有在存在钙的条件下与磷脂酰丝氨酸(ps)结合的能力。ps存在于每个细胞的质膜中，但是，凋亡细胞在质膜的外部小叶中表达ps。膜联蛋白v与暴露的ps结合，从而识别细胞凋亡。

3、对于darc的i期和ii期临床试验，anx776均通过静脉给药。通过共聚焦扫描激光检眼镜(cslo)成像用于检测视网膜疾病的其他荧光分子也主要通过静脉注射给药。例如，荧光素钠和吲哚菁绿(icg)通常静脉给药以标记视网膜脉管系统，以识别与年龄相关性黄斑变性(amd)有关的异常血管生长(血管生成)和渗漏(约齐克等，2005)。

4、静脉给药的使用需要直接的医学监督，意味着除非怀疑可疑病理，否则不会对患者进行常规评估。因此，需要可用于评估视网膜的替代技术，以使患者能够更广泛地进行此类评估，并可能更早地诊断视网膜和神经退行性疾病。

技术实现思路

1、根据本发明的第一方面，本发明提供了视网膜完整性的荧光标记，用于诊断中枢神经系统(cns)疾病，其中，荧光标记通过鼻内给药递送。出人意料的是，本技术的发明人发现，鼻内施用荧光标记导致视网膜中荧光的快速积累，视网膜成像的结果与先前静脉施用相同荧光剂后获得的结果相同。

2、不受理论的束缚，发明人相信，鼻内递送的视网膜完整性的荧光标记被系统吸收到循环中。由于局部给药，视网膜完整性的荧光标记可能需要减少剂量，且与相同试剂的全身给药相比起效更快。

3、如本说明书所用，视网膜完整性的荧光标记是指用于查询视网膜细胞的健康和/或视网膜细胞和/或血管的完整性的荧光标记。例如，荧光标记可以识别和/或区分凋亡和坏死细胞，或识别血管渗漏或血管生成的区域。响应于激发，荧光标记发光且可以具有约400nm至约1000nm，优选约500nm至约900nm的发射波长。

4、视网膜完整性的荧光标记优选以适合局部递送，尤其是鼻内递送的形式提供。视网膜完整性的荧光标记可以以药物组合物的形式提供，可以以适合吸入的溶液、悬浮液或干粉形式提供。包含视网膜完整性的荧光标记的药物组合物可以是无菌的，且可以包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。合适的载体和赋形剂是本领域技术人员所熟悉的，并且可以根据鼻内递送的预期途径进行优化。例如，包含视网膜完整性的荧光标记的组合物还可包含缓冲剂、粘合剂、防腐剂、增稠剂或抗氧化剂，如海藻糖。

5、在本发明的一些实施例中，视网膜完整性的荧光标记可以是视网膜血管完整性的荧光标记。通常，荧光标记将进入视网膜血管并在其中循环，从而易于观察到异常的血管生长(血管生成)和/或渗漏部位。

6、视网膜血管完整性的荧光标记可以具有约2kda或以下，或1kda或以下的分子量。在本发明的一些实施例中，视网膜血管完整性的荧光标记可具有约100da、或约1kda的分子量，优选约300da至约800da的分子量。

7、用于本发明的合适的视网膜血管完整性的荧光标记包括荧光团，特别优选的视网膜血管完整性的荧光标记包括荧光素钠和吲哚菁绿(icg)。

8、如上所述，视网膜血管完整性的荧光标记将通过鼻内给药，且可以与相同标记静脉内给药的剂量相同或更少的剂量来给药。例如，荧光素钠可以约50mg/ml至约500mg/ml的浓度鼻内施用，优选约50mg/ml至约200mg/ml的浓度。在本发明的一些实施例中，荧光素钠可以约以100mg/ml浓度鼻内施用。可以以浓度为约1mg/ml至约100mg/ml，优选约25mg/ml至约100mg/ml鼻内施用icg。在本发明的一些实施例中，icg可以约50mg/ml鼻内施用。

9、在本发明的一些实施例中，视网膜完整性的荧光标记可以是视网膜细胞完整性的标记。通常，视网膜细胞完整性荧光标记包括荧光标签和细胞凋亡、坏死、细胞活性、细胞应激或蛋白质聚集中的一种或多种标记。

10、荧光标签是指响应激发而发光的化合物或分子(如荧光团)，其可以选择使用，因为信噪比提高，从而在遵守曝光安全标准的同时提高了图像分辨率和灵敏度，避免光毒作用。优选荧光标签在给药时几乎不引起炎症或不引起炎症。荧光标签可以具有红外或近红外范围的波长。荧光标签可以具有约400nm至约1000nm，优选约500nm至约900nm，更优选约700nm至约900nm的发射波长。

11、合适的荧光标签包括荧光素钠、吲哚菁绿(icg)、姜黄素、irdye700、irdye800、dy-776、dy-488和d-781中的一种或多种。在本发明的优选实施例中，荧光标签是dy-776。

12、可以使用用于将荧光标签与标记结合的标准技术来制备视网膜细胞完整性荧光标记。这样的标记可以从众所周知的来源获得，例如dyomics。用于将标签与标记结合的适当技术是本领域已知的，并且可以由标签的制造商提供。

13、凋亡标记是指使经历凋亡的细胞与活细胞区分开的标记。此外，标记优选应能够从坏死细胞中区分凋亡细胞。例如，可以是特异性结合凋亡细胞但不结合活细胞或坏死细胞的化合物或分子。例如，凋亡标记包括膜联蛋白家族蛋白。膜联蛋白是在阳离子存在下可逆地结合到细胞膜上的蛋白质。特别地，膜联蛋白在钙存在的条件下能够结合磷脂酰丝氨酸(ps)。ps存在于每个细胞的质膜中，但是，凋亡细胞在质膜的外部小叶中表达ps。膜联蛋白与暴露的ps结合，从而识别细胞凋亡。可用于本发明的膜联蛋白可以是天然的或重组的。蛋白质可以是完整的，也可以是功能片段，也就是说，膜联蛋白的片段或部分特异性结合与整个蛋白质相同的分子。此外，可以使用此类蛋白质的功能性衍生物。特别地，膜联蛋白的功能片段或衍生物可以包括含有“膜联蛋白重复”的分子，是在单个膜联蛋白内和家族成员之间均保守的约70个氨基酸的结构域。可获得多种膜联蛋白，如美国专利申请公开号2006/0134001a中描述的膜联蛋白。优选的膜联蛋白是膜联蛋白5，其在本领域众所周知的。其他可以使用的膜联蛋白包括膜联蛋白11、2和6。其他凋亡标记在本领域中是已知的，例如，包括突触标签素i的c2a结构域、杜拉霉素、基于非肽的靛红磺酰胺类似物，例如wc-ii-89和aposense、例如nst-732、ddc和ml-10(圣休伯特等，2009)。

14、在本发明的优选实施例中，凋亡的标记是膜联蛋白128(泰特等，2005)。膜联蛋白128是膜联蛋白5的变体，与野生型的区别在于两个单氨基酸突变。膜联蛋白128在n-末端包括一个暴露的硫醇基，从而提高了分子标签(如荧光标记)的结合效率。

15、在本发明的优选实施例中，视网膜细胞完整性荧光标记包括与dy-776结合的膜联蛋白128，膜联蛋白128和dy-776可以以1∶1的荧光拉贝克标记比率结合。

16、坏死标记是指使经历坏死的细胞与活细胞、经历凋亡的细胞区分开的标记。例如，可以是特异性结合坏死细胞但不结合活细胞或凋亡细胞的化合物或分子。坏死的标记包括碘化丙啶(pi)，一种与核酸结合而几乎没有或没有序列优先性的嵌入剂。其他坏死标记在本领域中是已知的，包括焦磷酸盐、抗肌球蛋白、葡糖酸盐、金丝桃素及其衍生物，如金丝桃素一元羧酸和棕榈酸，例如双-酰肼-双dtpa棕榈酸。特别地，使用了99mtc-焦磷酸盐、111-抗肌球蛋白、99mtc-葡萄糖酸盐和亚甲基蓝。

17、细胞活性的其他指示也可以用于鉴定凋亡或坏死的细胞。例如，可以观察到线粒体功能的变化，可以将活性氧(ros)用作标记，可以将钙离子用作标记。细胞活性的标记可以包括膜染料、线粒体染料、自噬染料、坏死染料和钙流中的一种或多种。更特别地，细胞活性的标记可以包括fluo-3，n-(荧光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、jc-1，双发射jc-9、还原若丹明和罗米明、若丹明123和di-8-anepps中的一种或多种。细胞应激的标记可以包括脂质过氧化、谷胱甘肽(gsh)或活性氧(ros)(如超氧化物、过氧自由基、过氧化氢，羟基和过亚硝酸盐)中的一种或多种标记。

18、视网膜中的蛋白质聚集可以发生在视网膜神经元内或周围的细胞内或细胞外，但是，通常发生在视网膜脉管系统之外。已知蛋白质聚集体的存在与经历神经变性的细胞相关。合适的蛋白质聚集标记包括刚果红、姜黄素或硫黄素s中的一种或多种。

19、如上所述，本发明提供了鼻内递送的视网膜完整性的荧光标记，用于诊断受试者的cns病症。受试者优选是哺乳动物，包括人，可以是儿科病人或老年患者。可以通过分析视网膜完整性来识别cns病症，参见wo2009/077750和wo2011/055121描述的方法。例如，视网膜完整性的荧光标记可用于通过标记凋亡和/或坏死细胞来显示视网膜中细胞死亡的分布，根据分布可以区分具有不同凋亡和/或坏死活性模式的不同神经退行性疾病。

20、中枢神经系统疾病可能是炎性的(如关节炎或肉芽肿)、传染性的(如病毒、脑炎或细菌)、血管的(如血管生成、闭塞或代谢)，或退化性的(如青光眼、与年龄相关性黄斑变性(amd)、阿尔茨海默氏病或帕金森氏病)。在本发明的一些实施例中，cns病症可以是神经退行性疾病，尤其是眼神经退行性疾病。术语“眼神经退行性疾病”是本领域技术人员众所周知的，是指由眼神经元逐渐和进行性丧失引起的疾病，包括但不限于青光眼、amd、视神经炎和糖尿病性视网膜病变。神经退行性疾病包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和弗里德里希共济失调。在本发明的一些实施例中，cns病症可包括颅脑外伤、中风、脑瘫(如由新生儿缺氧引起的脑瘫)，和癌症(包括脑瘤)。

21、本发明还提供了一种用于诊断cns疾病的方法，其包括向患者施用如本技术描述的视网膜完整性的荧光标记并生成患者视网膜的图像，其中，视网膜完整性的荧光标记是鼻内施用的。患者视网膜的图像优选在体内产生，可以使用cslo成像获得。图像中荧光信号的存在或不存在可以指示cns疾病的存在或不存在，从而使临床医生能够诊断疾病的存在或不存在。如果图像中存在荧光信号，则荧光的位置和分布可以使临床医生区分中枢神经系统疾病的类型。例如，荧光信号可以指示血管生成或血管渗漏的部位。或者，荧光信号可以指示凋亡和/或坏死细胞的分布模式和/或数量。

22、本发明诊断方法还可以用于监测疾病的进展，例如，以评估治疗的有效性或对疾病进行分期。可以将患者眼睛的第一个体内图像与同一患者眼睛的后一个体内图像进行比较，后一个体内图像是在第一个图像后的几天、几周或几个月内拍摄的。荧光信号的变化可以指示疾病进展或有效的治疗方法。例如，荧光信号的增加可能表明凋亡细胞数量增加，可能表明疾病进展。可以根据wo2011/055121的描述，对图像进行分析。

23、在本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述视网膜细胞完整性的标记，其中，药物组合物包含与2kda或更小的化合物结合的膜联蛋白或其功能性片段或衍生物，其中膜联蛋白或其功能性片段或衍生物以至少5mg/ml的浓度存在。当膜联蛋白以约2mg/ml或更高的浓度存在时，包含膜联蛋白的组合物会遇到沉淀问题。但是，本技术的发明人已经能够解决该问题，以便提供包含浓度为至少5mg/ml的膜联蛋白的组合物。在避光条件下，该组合物已证明在25℃下可稳定储存长达50天。不受理论的束缚，本技术的发明人相信，2kda或更小的化合物与膜联蛋白的n-末端的结合可在空间上阻碍蛋白质聚集。

24、结合可以是静电的或共价的，化合物优选与膜联蛋白或其功能片段或衍生物的n-末端(即前30个氨基酸)结合。在本发明的一些实施例中，膜联蛋白或其功能片段或衍生物可以约5mg/ml至约20mg/ml，优选约5mg/ml至约10mg/ml的浓度存在。

25、化合物可以是有机化合物或无机化合物，且可以具有约100da至约2kda，优选约200da至约1kda，更优选约300da至约800da的尺寸。化合物可以是如上所述的荧光标记，或者可以是治疗剂。合适的荧光标记可以选自荧光素钠、吲哚菁绿(icg)、姜黄素、irdye700、irdye800、dy-776、dy-488和d-781中的一种或多种。在本发明的优选实施例中，荧光标记是dy-776。

26、在本发明的优选实施例中，药物组合物包含与dy776结合的膜联蛋白128。出人意料的是，已经评估了几种浓缩视网膜细胞完整性的标记的方法，结果证明与dy776结合的膜联蛋白128在高浓度下比膜联蛋白5更稳定。

27、药物组合物优选适合鼻内给药(如适合吸入的溶液、悬浮液或干粉)，且可以包含如上所述的合适的载体和/或赋形剂。药物组合物可以是冻干粉的形式，且可以以适合吸入的干粉的形式给予患者。或者，在施用前，可以将冻干粉再水化以形成悬浮液。

技术特征：

1.一种用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记通过鼻内给药递送。

2.根据权利要求1所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记呈粉末、悬浮液或溶液形式。

3.根据权利要求1或2所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记为视网膜血管完整性的标记。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记的分子量为约2kda或更小。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记选自荧光素钠或吲哚菁绿(icg)中的一种或多种。

6.根据权利要求1或2所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记是视网膜细胞完整性的标记。

7.根据权利要求1、2或6所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标记包括荧光标签和凋亡、坏死、细胞活性、细胞应激或蛋白质聚集中的一种或多种的标记。

8.根据权利要求6或7所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标签的发射波长约400nm至约1000nm。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述荧光标签选自荧光素钠、吲哚菁绿(icg)、姜黄素、irdye700、irdye800、dy-776、dy-488和d-781中的一种或多种。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述凋亡标记选自膜联蛋白、突触结合蛋白i的c2a结构域、杜拉霉素、非肽基异丁磺酰胺类似物，如wc-ii-89和aposense、如nst-732、ddc和ml-10中的一个或多个。

11.根据权利要求10所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述膜联蛋白选自膜联蛋白2、膜联蛋白5、膜联蛋白6、膜联蛋白11或膜联蛋白128中的一种或多种。

12.根据权利要求6至9中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述坏死标记选自碘化丙啶(pi)、焦磷酸盐、抗肌凝蛋白抗体、葡萄糖二酸盐、金丝桃素、金丝桃素一元羧酸、双羟萘酸、双酰肼-双-dtpa双羟萘酸、99mtc-焦磷酸盐、111-抗肌球蛋白、99mtc-葡萄糖二酸盐和亚甲基蓝中的一种或多种。

13.根据权利要求6至9中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述细胞活性标记选自膜染料、线粒体染料、自噬染料、坏死染料和钙流中的一种或多种。

14.根据权利要求6至9中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述细胞应激的标记选自脂质过氧化、谷胱甘肽(gsh)或活性氧(ros)中的一种或多种，如过氧化物、过氧基、过氧化氢、羟基、过(氧化)亚硝酸盐。

15.根据权利要求6至9中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述蛋白质聚集的标记选自刚果红、姜黄素或硫黄素thioflavin s中的一种或多种。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的用于诊断cns疾病的视网膜完整性的荧光标记，其中，所述cns疾病是炎性的(如关节炎或肉芽肿)、感染性的(如病毒性、脑炎性或细菌性)、血管的(如血管原性、闭塞或代谢)，或退化性性的(如青光眼、与年龄相关的黄斑变性(amd)、阿尔茨海默症或帕金森氏症)。

17.一种诊断cns疾病的方法，其包括对受试者施用视网膜完整性的荧光标记并生成受试者眼睛的图像，其中，所述荧光标记通过鼻内给药递送。

18.根据权利要求17所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标记呈粉末、悬浮液或溶液形式。

19.根据权利要求17或18所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标记是视网膜血管完整性的标记。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标记的分子量为约2kda或更小。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标记选自荧光素钠或吲哚菁绿(icg)中的一种或多种。

22.根据权利要求17或18所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标记是视网膜细胞完整性的标记。

23.根据权利要求17、18或22所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标记包括荧光标签和凋亡、坏死、细胞活性、细胞应激或蛋白质聚集中的一种或多种的标记。

24.根据权利要求22或23所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标签的发射波长约400nm至约1000nm。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述荧光标签选自荧光素钠、吲哚菁绿(icg)、姜黄素、irdye700、irdye800、dy-776、dy-488和d-781中的一种或多种。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述凋亡标记选自膜联蛋白、突触结合蛋白i的c2a结构域、杜拉霉素、非肽基异丁磺酰胺类似物，如wc-ii-89和aposense、如nst-732、ddc和ml-10中的一个或多个。

27.根据权利要求26所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述膜联蛋白选自膜联蛋白2、膜联蛋白5、膜联蛋白6、膜联蛋白11或膜联蛋白128中的一种或多种。

28.根据权利要求22至25中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述坏死标记选自碘化丙啶(pi)、焦磷酸盐、抗肌凝蛋白抗体、葡萄糖二酸盐、金丝桃素、金丝桃素一元羧酸、双羟萘酸、双酰肼-双-dtpa双羟萘酸、99mtc-焦磷酸盐、111-抗肌球蛋白、99mtc-葡萄糖二酸盐和亚甲基蓝中的一种或多种。

29.根据权利要求22至25中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述细胞活性标记选自膜染料、线粒体染料、自噬染料、坏死染料和钙流中的一种或多种。

30.根据权利要求22至25中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述细胞应激的标记选自脂质过氧化、谷胱甘肽(gsh)或活性氧(ros)中的一种或多种，如过氧化物、过氧基、过氧化氢、羟基、过(氧化)亚硝酸盐。

31.根据权利要求22至25中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述蛋白质聚集的标记选自刚果红、姜黄素或硫黄素thioflavin s中的一种或多种。

32.根据权利要求17至31中任一项所述的诊断cns疾病的方法，其中，所述cns病症是炎性的(如关节炎或肉芽肿)、感染性的(如病毒性、脑炎性或细菌性)、血管的(如血管原性、闭塞或代谢)，或退化性的(如青光眼、与年龄相关的黄斑退化(amd)、阿尔茨海默症或帕金森氏症)。

33.一种药物组合物，包含与2kda或更小的化合物结合的膜联蛋白或膜联蛋白的功能片段或衍生物，其中，药物组合物包含在至少5mg/ml浓度下结合的膜联蛋白或膜联蛋白的功能性片段或衍生物。

34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中，所述膜联蛋白或膜联蛋白的功能片段或衍生物为膜联蛋白128，其中，2kda或以下的化合物为dy776。

技术总结
本发明提供了一种CNS疾病的诊断方法，包括向受试者施用视网膜完整性的荧光标记并生成受试者眼睛的图像，其中，还提供了通过鼻内给药递送荧光标记，以及在此方法中使用的鼻内给药的视网膜完整性的荧光标记。此外，本发明还提供了一种药物组合物，其包含结合至2kDa或更小的化合物的膜联蛋白或其功能性片段或衍生物，其中，药物组合物包含在浓度至少为mg/ml下结合的膜联蛋白或其功能性片段或衍生物。

技术研发人员：本杰明·迈克尔·戴维斯,玛丽亚·弗朗西斯卡·科迪里奥,郭丽
受保护的技术使用者：UCL商业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5