体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系和方法及应用
本发明涉及生物医药工程，涉及一种于体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系和方法及应用。
背景技术：
1、肝衰竭是由急性或慢性因素引起的严重肝脏损害，可导致肝脏的合成、代谢、生物转化等功能发生严重障碍或失代偿。肝衰竭进入晚期后常规内外科手段都无法有效治疗，目前原位肝移植(orthotopic liver transplantation，olt)是治疗晚期肝衰竭最为有效的手段。然而供体肝脏短缺，使得部分患者在移植等待过程中死亡；而且原位肝移植还存在费用高昂、并发症高发以及需终身服用免疫抑制剂等局限。
2、相较于原位肝移植，肝细胞移植具备诸多潜在优势：1.术式操作更简单，侵入性小，成本相对较低；2.视病情需要可反复进行移植以维持疗效；3.细胞可置于低温环境下保存备用；4.保留患者自体肝脏；5.患者仅需自体5％-15％数量的肝细胞，即可达到治疗效果；6.一个供体肝源可匹配多位患者等。但是高质量的肝细胞同样存在来源匮乏的问题。近些年，随着干细胞技术及细胞重编程技术的发展，已有多种细胞展现出修复损伤肝脏的良好潜力。
3、原代肝细胞(primary hepatocytes，phs)是终末期肝病细胞治疗的有效细胞。自1992年报道了第一例利用肝细胞移植治疗肝硬化患者以来，目前已经有超过100例肝细胞移植临床应用的报道。原代肝细胞应用于临床的主要瓶颈问题之一，是原代肝细胞无法在体外同时保持增殖能力和代谢功能，易于发生去分化和细胞老化。实际上即便是新鲜分离的肝细胞，在体外短时间培养也会因去分化而丧失成熟肝细胞的关键功能，这些缺点极大地限制了肝细胞移植在临床中的广泛应用，发展在体外具有功能性的肝脏细胞是可能的解决方案之一。
技术实现思路
1、本发明是为解决上述问题而进行的，针对现有技术中肝细胞分离后功能难以维持的问题，提供了一种通过抑制teadomain(tead)及bromodomain and extraterminaldomain(bet)家族蛋白信号通路体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系及培养方法，还提供了其应用。
2、本发明的第一方面，提供了一种能够于体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系，包含基础培养基以及与该基础培养基组合使用的培养因子。
3、其中，培养因子为bet抑制剂或者bet抑制剂和tead抑制剂的组合，
4、所述bet抑制剂的浓度为0.001～10μm，所述tead抑制剂的浓度为0.01～10μm。
5、使用该培养体系，可以显著抑制肝细胞的去分化，尤其是两种抑制剂组合可以更好的维持肝细胞功能分子alb和hnf4a的表达；同时两种抑制剂组合能诱导去分化肝细胞再分化。该培养体系可以较长时间维持肝细胞的功能，alb、hnf4α等成熟肝细胞标志分子表达水平可维持7天以上。
6、优选的，基础培养基以及培养因子的组成如下：
7、所述基础培养基包括液体基础培养基、0-5×b27添加剂、0-5×n2添加剂、1％青霉素/链霉素、0-100mm尼克酰胺、0-1mm地塞米松、0-500μg/ml维生素c。该配方组成中，存在各添加元素均为0的组合情况，为了避免该情形，将各组分的最低量限定为0.001。
8、bet抑制剂选自bi894999、bay1238097、abbv-744、birabresib、trotabresin中的任意一种或多种；
9、tead抑制剂选自vt107、vt104、k975、iag939中的任意一种或多种。
10、进一步优选，基础培养基为dmem/f12液体基础培养基；
11、b27添加剂的量为0.5×b27添加剂，n2添加剂的量为0.5×n2添加剂，尼克酰胺的浓度为2mm，地塞米松的浓度为10mm，维生素c的浓度为60μg/ml；
12、bet抑制剂的浓度为0.001～5μm(最优选2μm)，tead抑制剂的浓度为0.01～5μm(最优选2μm)。
13、本发明的具体实施方式中，采用上述组分进行实验，但每种组分中不限于上述具体成分。如，bet抑制剂中，选择2μm的bi894999进行实验，但其余记载的bet抑制剂也能实现相应功能。tead抑制剂的成分选择亦然。
14、本发明的第二方面，提供了采用上述所述的培养体系于体外长期维持成熟肝细胞功能的方法，包括如下步骤：分离获得原代肝细胞后，将原代肝细胞悬液离心收集细胞沉淀，并将其悬浮于无血清的基础培养基中，而后均匀接种于matrigel包被的培养皿中，培养基中添加上述培养因子。
15、优选的，原代肝细胞悬液离心条件如下：50g离心2次，每次5分钟；
16、原代肝细胞为哺乳动物的成熟肝细胞，如小鼠、大鼠或人的原代成熟肝细胞。
17、培养结果显示，bet抑制剂和两类抑制剂组合的处理相对维持了肝脏功能基因alb、hnf4a、酪氨酸氨基转移酶(tyrosine aminotransferase，tat)和ttr的表达；同时，还抑制了肝脏祖细胞相关的分子如afp和ck19的表达。细胞免疫荧光染色进一步证实了bet抑制剂和两类抑制剂组合的处理可以显著抑制肝细胞的去分化，尤其是抑制剂组合可以更好的维持肝细胞功能分子alb和hnf4a的表达。证实bet抑制剂和两类抑制剂组合可在体外维持成熟肝细胞的功能。
18、进一步对诱导去分化肝细胞的再分化效果进行验证，原代肝细胞在基础培养基中培养一周，再加入抑制剂组合后，alb和hnf4a的表达都显著上调，证明抑制剂组合能诱导去分化肝细胞再次分化。
19、据此，本发明的第三方面，提供了根据本发明的培养方法获得的肝细胞在肝脏组织工程、肝衰竭治疗细胞以肝脏疾病体外药物筛选中的应用。根据本发明的研究方法有助于获得体外肝细胞功能去分化的新机制、体外维持肝细胞功能的新途径、治疗肝脏疾病模型的应用潜能。
20、本发明的有益保障及效果如下：
21、通过实验，使用本发明的研究方法可以在体外长期维持成熟肝细胞功能的功能达7天以上。本发明研究表明，bet抑制剂、以及bet抑制剂和tead抑制剂的组合可在体外部分维持原代肝细胞功能；且抑制剂组合可以诱导去分化肝细胞的再次分化。上述结果表明本研究在肝脏疾病治疗方面具有重要的应用潜能和优势。
技术特征：
1.一种体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系，其特征在于，包含基础培养基以及与该基础培养基组合使用的培养因子，
2.根据权利要求1所述的体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，其特征在于：
5.采用权利要求1～4任一项所述的培养体系于体外长期维持成熟肝细胞功能的方法，其特征在于，包括如下步骤：分离获得原代肝细胞后，将原代肝细胞悬液离心收集细胞沉淀，并将其悬浮于无血清的基础培养基中，而后均匀接种于matrigel包被的培养皿中，培养基中添加所述培养因子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
9.根据权利要求5中的培养方法获得的肝细胞在肝脏组织工程、肝衰竭治疗细胞以肝脏疾病体外药物筛选中的应用。
技术总结
本发明提供了体外长期维持成熟肝细胞功能的培养体系和方法及应用。其中，该培养体系包含基础培养基以及与该基础培养基组合使用的培养因子，培养因子为BET抑制剂或者BET抑制剂和TEAD抑制剂的组合，BET抑制剂的浓度为0.001～5μM，TEAD抑制剂的浓度为0.01～10μM。培养方法如下：分离获得原代肝细胞后，将原代肝细胞悬液离心收集细胞沉淀，并将其悬浮于无血清的基础培养基中，而后均匀接种于Matrigel包被的培养皿中，培养基中添加上述培养因子。使用本发明的研究方法可以在体外长期维持成熟肝细胞功能的功能达7天以上，表明本研究在肝脏疾病治疗方面具有重要的应用潜能和优势。
技术研发人员：李文林,陆俊宇,张吉芊竹,梁书龙,朱江波,孙平新,虞欣璐,汪超,吕竺蔓,王春艳
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5