一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法

本发明涉及农作物抗病育种，具体为一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法。

背景技术：

1、cmv是雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属的典型成员，其病毒粒子形态为等轴对称的正二十面体球状，直径约29nm，cmv基因组包含rna1、rna2和rna3三条正单链rna，其中rna1大小为3390～3410nt，rna2为3035～3350nt，rna3为2190～2200nt，cmv基因组共编码5个开放阅读框，其中位于rna1的orf编码111～112kda的1a蛋白，该蛋白具有甲基转移酶和解旋酶活性；rna2具有2个orf，分别编码11～13kda的2a蛋白和13kda的2b蛋白，2a蛋白是cmv的复制酶，2b蛋白是cmv的病毒沉默抑制子；rna3也具有两个orf，分别编码31kda的3a蛋白和24～26kda的外壳蛋白，3a蛋白是cmv的移动蛋白，cmv能侵染包括蔬菜、油料、果树和花卉等重要经济作物在内的100多科500多属1300多种植物，2013-2017的调查发现，cmv已成为危害我国蔬菜作物的优势病毒，在31个省(市、自治区)均有分布，常与其他病毒复合侵染茄科、葫芦科、豆科和十字花科蔬菜，对我国的蔬菜造成严重危害。

2、但是cmv接毒体系的不成熟为各种作物的抗cmv病毒品种筛选以及cmv相关研究工作带来了困难，目前常用的接毒方法是利用病毒汁液摩擦接种寄主的方法，此方法仅在烟草上具有较好的接毒效率，在番茄、黄瓜和辣椒等作物上的接毒效率较低，且不同批次之间发病率及病症严重程度等差异较大，对抗病性评估带来了极大的障碍，使用蚜虫传毒，需要具备培养蚜虫的设施和技能，无法控制初始接毒量的一致性，工作难度大，不同批次间重复性差，同时有极大的蚜虫失控风险，一旦失控，将对供试材料甚至非供试材料造成毁灭性危害。

3、为此，我们研发出了新的一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，解决了利用病毒汁液摩擦接种寄主的方法，在番茄、黄瓜和辣椒等作物上的接毒效率较低，且不同批次之间发病率及病症严重程度等差异较大，对抗病性评估带来了极大障碍的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，包括以下具体步骤：

5、s1、扩繁：通过利用dcl2/4i本氏烟扩繁cmv病毒；

6、s2、提取：提取cmv病毒粒子；

7、s3、接种：通过s2中的cmv病毒粒子摩擦接种番茄幼苗；

8、s4、培育：番茄幼苗培养。

9、优选的，所述s1中通过利用dcl2/4i本氏烟扩繁cmv病毒，又包括以下具体步骤：

10、s101：首先将硅藻土均匀喷洒于4-5叶期大小的dcl2/4i本氏烟植株上；

11、s102：将cmv侵染致病后的叶片加入buffer c，通过使用研钵研磨成匀浆，再取研磨后的匀浆倒入dcl2/4i本氏烟植株叶片上，轻轻摩擦至微伤口产生；

12、s103：摩擦完3-5分钟后，喷洒水在摩擦过的叶片上，后将其置放入24℃温室内暗培养24小时，而后，在24℃和10h光照/14h黑暗条件下揭盖，再正常培养14-21天。

13、优选的，所述s2中的cmv病毒粒子提取，又包括以下具体步骤：

14、s201：将50g cmv侵染致病的叶片、75ml buffera、375μl tga和75ml氯仿共同放入破壁机中，将叶片破碎成匀浆；

15、s202：使用4℃的磁力搅拌，搅拌s201中的匀浆1-2h，然后将搅拌后的匀浆平均分装于4个50ml离心管中，再通过8000rcf对离心管内的匀浆离心15min；

16、s203：吸取s202中离心管内的上清液，将其转移至超速离心机配套管中，每管上清液含量为27ml，并加入5ml buffer a和10％蔗糖缓冲液的混合液，然后以37000rpm，对上述混合物离心1.5h。

17、s204：将s203离心1.5h后的上清液倒出，并向每个管中加入1ml buffer c溶液，后将其一并汇总到一个50ml管中，以4℃放置一夜；

18、s205：将s204中放置一夜的50ml管，以8000rcf离心10min，后吸取上清液，再通过使用分光光度计测a260，并计算浓度；

19、s206：在s205中的吸取的上清液内，以1：1体积比加入10％浓度的甘油，并计算最终浓度，后将所提的病毒粒子分装于1.5ml离心管中，以-80℃进行保存。

20、优选的，所述s3中通过cmv病毒粒子摩擦接种番茄幼苗，又包括以下具体步骤：

21、s301：首先，使用buffer c溶液将病毒粒子稀释至30ng/μl；

22、s302：再使用喷粉器将100目的硅藻土均匀喷洒在仅2片子叶的番茄幼苗上；

23、s303：后使用移液器将病毒粒子(30ng/μl)分别点15μl在每片叶子上，每株番茄接种30μl；

24、s304：然后，轻轻摩擦s303中的叶子3-5次，至有微伤口产生即可，摩擦完3-5分钟后，喷洒水于摩擦过的叶片上；

25、s305：将侵染完成的番茄幼苗盖上盖子，以24℃的室温，暗培养24小时后揭盖。

26、优选的，所述s4中的番茄幼苗温度培养条件为24℃，所述s4中的番茄幼苗光照培养条件为8000lux的光照强度，所述s4中的番茄幼苗光照培养条件为10h光照/14h黑暗。

27、优选的，所述203中超速离心机配套管的转子型号为p70at，并且，配套管的规格为40ml×2。

28、(三)有益效果

29、本发明提供了一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法。具备以下有益效果：

30、1、该种通过黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，通过采用病毒粒子侵染番茄幼苗，显著提高了cmv侵染番茄的效率和稳定性，发病症状明显，重复性好，可大规模接种，有利于抗cmv番茄品种的高效筛选。

31、2、该种通过黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，通过采用两片子叶大小的番茄幼苗作为接种材料，且接种两周后即可观察到典型的发病症状，极大缩短了实验周期，显著提高了抗cmv种质材料筛选周期和相关研究工作实验周期。

32、3、该种通过黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，通过采用dcl2/4i本氏烟扩繁cmv病毒粒子，缩短了cmv病毒粒子扩繁周期，显著提高了cmv病毒粒子产率。

33、4、该种通过黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，通过以番茄萌发7天后，两片子叶刚好舒展开的幼苗为接毒材料，而其余的cmv接种方法所需材料多为播种为3-4周后的植物，本发明所述方法缩短了接毒周期，可以加快育种速度，更快地选育出对cmv抗性强的番茄品种，其次，减少了评价周期，也意味着更快的了解植物对cmv的反应，有利于及时调整育种策略和提高育种效率。

技术特征：

1.一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

2.根据权利要求1所述的一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，其特征在于：所述s1中通过利用dcl 2/4i本氏烟扩繁cmv病毒，又包括以下具体步骤：

3.根据权利要求1所述的一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，其特征在于：所述s2中的cmv病毒粒子提取，又包括以下具体步骤：

4.根据权利要求1所述的一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，其特征在于：所述s3中通过cmv病毒粒子摩擦接种番茄幼苗，又包括以下具体步骤：

5.根据权利要求1所述的一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，其特征在于：所述s4中的番茄幼苗温度培养条件为24℃，所述s4中的番茄幼苗光照培养条件为8000lux的光照强度，所述s4中的番茄幼苗光照培养条件为10h光照/14h黑暗。

6.根据权利要求3所述的一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，其特征在于：所述203中超速离心机配套管的转子型号为p70at，并且，配套管的规格为40ml×2。

技术总结
本发明提供一种黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，涉及农作物抗病育种技术领域。该种通过黄瓜花叶病毒高效稳定接种番茄的方法，包括以下具体步骤：S1、扩繁：通过利用dc l 2/4i本氏烟扩繁CMV病毒；S2、提取：提取CMV病毒粒子；S3、接种：通过S2中的CMV病毒粒子摩擦接种番茄幼苗；S4、培育：番茄幼苗培养。通过采用病毒粒子侵染番茄幼苗，显著提高了CMV侵染番茄的效率和稳定性，并且，dc l 2/4i本氏烟扩繁CMV病毒粒子，缩短了CMV病毒粒子扩繁周期，显著提高了CMV病毒粒子产率，可重复大规模接种，有利于抗CMV番茄品种的高效筛选。

技术研发人员：赵丽玲,郭忠新,徐倩,陈颖芳,曹佳敏,金丽颖,高海英,何婷
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5