构建功能性外泌体的方法与流程

本申请涉及生物，尤其涉及一种构建功能性外泌体的方法。

背景技术：

1、外泌体(exosomes)是一种大小约30-150nm的细胞外囊泡，具有脂质双层膜结构其携带大量蛋白、脂质、dna和rna(mirna、mrna、lncrna、circrna)等重要信息，不仅参与细胞间通讯和信息交流，根据外泌体来源的细胞类型，其还在抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤修复等多方面起重要作用。

2、人体内几乎所有细胞在正常或病理状态下均可分泌外泌体，比如免疫细胞、内皮细胞、肿瘤细胞等。不同细胞来源的外泌体其所包含的活性物质功能特性也存在一定的差异，当外泌体由宿主细胞分泌并传递至受体细胞时，主要通过其所包含的活性物质调节或改变受体细胞的功能和生理状态。近几年的研究证实，外泌体中的内容物(如mirna)与疾病有着非常紧密的关系，如参与免疫疾病、病毒感染、神经退行性疾病传播、癌症发生和转移等，并且可作为疾病诊断的生物标志物。

3、有报道cd63、cd9、cd81、fprp等跨膜蛋白都有特异性表达及在外泌体的膜上富集，外泌体功能性研究近年来在各个领域进行。

技术实现思路

1、本申请的目的是，至少克服现有技术的不足，提供一种快捷的适用于高通量操作的构件功能性外泌体的方法。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、一种构建功能性外泌体的方法，其包括以下步骤：

4、利用目标基因构建入门载体；

5、利用编码外泌体特异性膜蛋白的基因构建接受载体；

6、触发所述入门载体与接受载体发生重组生成表达载体；

7、将所述表达载体导入可分泌外泌体的宿主细胞中，获得功能性外泌体；

8、所述目标基因包含但不仅限于下列基因的全长或部分序列：抗体、细胞因子、蛋白标签、荧光蛋白基因、荧光素酶基因；

9、所述表达载体含有所述目标基因和编码外泌体特异性膜蛋白的基因的融合基因。

10、可选择地，所述接受载体采用慢病毒载体。

11、优选地，所述慢病毒载体分别在cmr基因上游插入attr1元件和ccdb基因下游插入attr2元件，再与所述编码外泌体特异性膜蛋白的基因连接，形成所述接受载体；所述目标基因两端分别连接attb1元件和attb2元件，以用于构建入门载体。

12、可选择地，通过pcr扩增的方式在所述编码外泌体特异性膜蛋白的基因中引入所述慢病毒载体。

13、进一步地，所述编码外泌体特异性膜蛋白基因被预先构建成中转载体。

14、优选地，利用pcr筛选所述接受载体和/或表达载体。

15、可选择地，所述蛋白标签包含但不限于以下类型：snap/clip tag，halotag，avitag；所述荧光蛋白基因包含但不限于以下类型：gfp，rfp，mcherry；所述荧光素酶基因包括但不限于以下类型：gluc，fluc，rluc，nanoluc。

16、进一步可选择地，所述所述编码外泌体特异性膜蛋白的基因包含但不限于以下基因的全长或部分序列：cd63、cd9、cd81或fprp。

17、其中一些实施方式中，当利用cd63的全长或部分序列构建所述接受载体时，所使用的引物对如seq id no.1所示的核酸序列和seq id no.2所示的核酸序列；当利用fprp的全长或部分序列构建所述接受载体时，所使用的引物对如seq id no.3所示的核酸序列和seq id no.4所示的核酸序列。

18、与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

19、本申请提供了一种构建功能性外泌体的方法，形成外泌体标记的高通量快速克隆体系；此克隆体系利用gateway技术，简便快速将多种不同功能基因或tags插入外泌体上的特异性膜蛋白中，使外泌体获得标记、导向或功能增强。首先，在外泌体上的特异性膜蛋白，如cd63、cd9、cd81、fprp等的克隆载体上，依据不同膜蛋白的特性，将gateway克隆序列attr元件导入特定位置。再以这些克隆载体作为接受载体(destination vector)，从entryclones的基因文库中挑选出各种待测基因标记或功能性或导向性tags，通过lr反应，导入到这些外泌体特异性膜蛋白上生成融合基因。本申请既能高效外泌体标记，也能高通量筛选各种基因在外泌体膜上的表达对外泌体功能产生的影响和效果，包括外泌体导向及功能增益。

技术特征：

1.一种构建功能性外泌体的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接受载体采用慢病毒载体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体分别在cmr基因上游插入attr1元件和ccdb基因下游插入attr2元件，再与所述编码外泌体特异性膜蛋白的基因连接，形成所述接受载体；所述目标基因两端分别连接attb1元件和attb2元件，以用于构建入门载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，通过pcr扩增的方式在所述编码外泌体特异性膜蛋白的基因中引入所述慢病毒载体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述编码外泌体特异性膜蛋白基因被预先构建成中转载体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用pcr筛选所述接受载体和/或表达载体。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白标签包含但不限于以下类型：snap/clip tag，halotag，avitag；所述荧光蛋白基因包含但不限于以下类型：gfp，rfp，mcherry；所述荧光素酶基因包括但不限于以下类型：gluc，fluc，rluc，nanoluc。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述所述编码外泌体特异性膜蛋白的基因包含但不限于以下基因的全长或部分序列：cd63、cd9、cd81或fprp。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，当利用cd63的全长或部分序列构建所述接受载体时，所使用的引物对如seq id no.1所示的核酸序列和seq id no.2所示的核酸序列；当利用fprp的全长或部分序列构建所述接受载体时，所使用的引物对如seq id no.3所示的核酸序列和seq id no.4所示的核酸序列。

技术总结
本申请公开一种构建功能性外泌体的方法，其包括以下步骤：利用目标基因构建入门载体；利用编码外泌体特异性膜蛋白的基因构建接受载体；触发所述入门载体与接受载体发生重组生成表达载体；将所述表达载体导入可分泌外泌体的宿主细胞中，获得功能性外泌体；所述目标基因包含但不仅限于下列基因的全长或部分序列：抗体、细胞因子、蛋白标签、荧光蛋白基因、荧光素酶基因；所述表达载体含有所述目标基因和编码外泌体特异性膜蛋白的基因的融合基因。本申请形成外泌体标记的高通量快速克隆体系，简便快速将多种不同功能基因或Tags插入外泌体上的特异性膜蛋白中，使外泌体获得标记、导向或功能增强。

技术研发人员：徐学明,杨淑伟,刘蕾
受保护的技术使用者：广州复能基因有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5