丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其在生产氨基酸中的应用
本发明属于生物，具体涉及丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其生产氨基酸中的应用。
背景技术：
1、氨基酸(aminoacid)，是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，是构成人体和动物蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态和生化活性，常见的氨基酸包括谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸等22种，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中。
2、目前，氨基酸主要通过微生物发酵法、化学合成法、蛋白质水解提取法进行生产，而微生物发酵法是当前最主要的生产方法，主要的生产菌株包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等。随着生物技术的不断发展，对生产菌株进行代谢工程改造来提高其氨基酸产量的报道逐渐增多，如增强氨基酸合成途径相关酶的表达，降低竞争性途径相关酶的表达等。
3、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，由pyc基因编码)，是糖异生的限速酶，能够将丙酮酸和二氧化碳催化生成草酰乙酸，从而进入三羧酸循环。现有技术表明，强化丙酮酸羧化酶的表达，可促进以草酰乙酸为前体的目标产物的生产，包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等以草酰乙酸为重要代谢前体的氨基酸的生产(如cn110603321a，cn1275167a，cn103981203b，peters-wendisch p g,schiel b,wendisch vf,et al.pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysineproduction by corynebacterium glutamicum.j mol microbiolbiotechnol,2001,3(2):295-300.)因此，研究人员通过增加pyc基因拷贝数或替换强启动子的方式对pyc基因进行过表达，以便增加目标产物的产量，如cn113755492a通过对pyc基因启动子的核心区进行突变，获得了一系列不同强度的pyc基因启动子突变体，应用这些强启动子表达pyc基因后，增加了工程菌株的脯氨酸产量。然而，本领域仍需开发更高活性的启动子元件，以便进一步增强pyc等基因的表达，从而提高菌株目标产物的产量和转化率。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足和需求，本发明人研究寻找具有增强活性的相关启动子而完成本发明。
2、第一方面，本发明提供一种启动活性提高的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其在对应于seq id no.2所示核苷酸序列的启动子的第355位至第365位存在突变。
3、进一步优选地，所述突变体的核苷酸序列如seq id no：3至seq id no：8任一项所示。
4、其中丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体是具有启动子活性的核苷酸分子，并相对于野生型的启动子具有增强的活性。所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为rna聚合酶提供识别位点，并位于mrna转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，rna聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。
5、所述编码丙酮酸羧化酶的基因为pyc基因，被认为是棒杆菌回补途径中发挥重要作用的酶，该酶能够催化丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸，这是三羧酸循环的一个重要回补途径。已有大量的文献报道，过表达丙酮酸羧化酶pyc可以增加菌株的氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)产量。
6、本发明的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因的启动子，它比野生型启动子具有更高的启动子活性。本发明的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过pcr来分离本发明的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动dna合成仪通过标准合成技术来制备本发明的启动子核酸分子。
7、本发明的具有启动子活性的核酸分子可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如天冬氨酸激酶lysc、苏氨酸操纵子thrabc、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、天冬氨酸氨裂合酶aspb、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸o-乙酰基转移酶metx、二氢吡啶二羧酸合成酶dapa、二氢吡啶甲酸还原酶dapb、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶ddh、谷氨酸激酶prob、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proa、吡咯-5-羧酸脱氢酶proc、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶puta、5-氨基乙酰丙酸合成酶hema等等。
8、本发明的所述的系列强度启动子元件，可用于适度调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。
9、本发明所使用的术语“棒杆菌”是指棒杆菌属的微生物，包括但不限于谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067，以及由上述菌株制备的产生氨基酸的突变体或菌株。
10、第二方面，本发明提供了包含所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的表达盒、重组载体。
11、所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。
12、术语“载体”指的是dna构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的dna序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的pec-xk99e质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
13、第三方面，本发明提供了含有所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的重组宿主细胞。
14、重组宿主细胞具体例如通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(capo4)沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法。
15、本发明所述“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067，以及由上述菌株制备的产生l-氨基酸的突变体或菌株。
16、在一些实施方式中，对于谷氨酸生产菌株，可以是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869基础上改造获得的菌株，这些改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
17、a.编码机械敏感通道蛋白的yggb基因(cn108250278a)；
18、b.编码磷酸转酮酶的fxpk基因(wo2006016705a1)；
19、c.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(wo2004069996a2)；
20、d.编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因(cn103205390a)；
21、e.编码碳酸酐酶的基因(wo2011024583a1)。
22、在一些实施方式中，所述谷氨酸生产菌株中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
23、a.编码α-酮戊二酸脱氢酶的odha基因(wo2006028298a2)；
24、b.编码转录调控基因的amtr基因(ep2276845a1)；
25、c.编码转录抑制子的acnr基因(cn111334535a)。
26、在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，具体地是在所述菌中的ncgl1221同源基因(bbd29_06760或yggb)中引入a111v突变，glta基因中引入c361y突变，glta基因启动子引入pglta-ts24突变，获得的谷氨酸生产菌株scggc9。也可以是在scggc9中引入pgdh-rbs19启动子突变体，获得的谷氨酸生产菌株scggc16。
27、在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。
28、第四方面，本发明提供了一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地链接，优选地增强以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关基因的表达。
29、本发明中的术语“可操作地连接”是指本发明的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明的所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。
30、第五方面，本发明提供了一种以草酰乙酸为前体的目标产物的生产方法，所述方法包括培养含有所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的目标产物。其中，以草酰乙酸为前体的目标产物包括但不限于氨基酸及其衍生物，所述氨基酸包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等，所述衍生物包括但不限于戊二胺、戊二酸等。通过本发明的方法，可以提高菌株的以草酰乙酸为前体的目标产物的产量。更具体的，以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因选自pyc基因，lysc基因、thrabc基因、asd基因、aspb基因、hom基因、metx基因、dapa基因、dapb基因、ddh基因、prob基因、proa基因、proc基因、puta基因、hema基因等。
31、本发明所述的生产以草酰乙酸为前体的目标产物的方法中，利用本发明的所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收目标产物的步骤。从细胞或培养基中回收目标产物的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和hplc。
32、本发明的有益效果：本发明提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可以用于目标基因的表达，尤其是与氨基酸生产相关基因的表达，例如与pyc基因可操作地连接，可以增强丙酮酸羧化酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸生产效率，具有较高的应用价值。
技术特征：
1.一种启动活性提高的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其在对应于seq id no.2所示核苷酸序列的启动子的第355位至第365位存在突变，且相对于野生型的启动子具有增强的活性；
2.包含如权利要求1所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的表达盒、重组载体。
3.含有如权利要求1所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，或其表达盒的重组宿主细胞。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067，以及由上述菌株制备的产生l-氨基酸的突变体或菌株。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869基础上改造获得的菌株，这些改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述谷氨酸生产菌株中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌进一步地经过改良，其中的ncgl1221同源基因中引入a111v突变，glta编码基因中引入c361y突变，或glta基因启动子引入pglta-ts24突变，或引入pgdh-rbs19启动子突变体而获得的谷氨酸生产菌株。
9.一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将如权利要求1所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地链接，优选地增强以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关基因的表达。
10.一种以草酰乙酸为前体的目标产物的生产方法，所述方法包括培养含有如权利要求1所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的目标产物；
技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其生产氨基酸中的应用。所述突变体在对应于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的启动子的第355位至第365位存在突变，且相对于野生型的启动子具有增强的活性。本发明提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可以用于目标基因的表达，尤其是与氨基酸生产相关基因的表达，例如与pyc基因可操作地连接，可以增强丙酮酸羧化酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸生产效率，具有较高的应用价值。
技术研发人员：孙际宾,陈久洲,李广玉,蔡柠匀,郑平,刘娇,刘世周,周文娟,赵兰坤,王小平
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5