特异性结合胰蛋白酶蛋白的单克隆抗体及其在检测中的应用的制作方法

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种可分泌抗胰蛋白酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用，所述胰蛋白酶包括重组胰蛋白酶。

背景技术：

1、重组胰蛋白酶(recombinant porcine trypsin，rpt)蛋白可特异切割赖氨酸及精氨酸c末端肽键，可降解细胞间结合蛋白。重组胰蛋白酶蛋白的氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶一致，由重组大肠杆菌表达生产。可替代传统提取胰酶用于疫苗、干细胞、免疫细胞治疗、药物筛选、抗体等领域细胞消化过程。

2、在现代生物制药生产过程中，动物源性原料的使用存在的最大潜在风险是可能会引入人畜共患病的潜在病毒。重组胰蛋白酶生产过程不使用任何动物源原料。无外源性的病毒污染，使用安全。广泛应用于：(1)重组蛋白药物的生物试剂，如胰岛素及类似物生物试剂，glp-1类似物生物试剂；(2)各种细胞培养，如疫苗生物试剂，干细胞的分离等；(3)蛋白质结构与功能研究，如蛋白质质谱、测序、肽图谱分析；(4)小分子蛋白或多肽的生物试剂，如美容肽，抗菌肽、食品风味肽的生物试剂等。因此，对重组胰蛋白酶蛋白的定量检测或控制就尤为重要。

3、目前，重组胰蛋白酶蛋白的定量测定，尽管已经开发了酶联免疫检测方法，但目前在售商用试剂盒存在灵敏度低，特异性差，操作复杂的缺点。因此，进一步实施改进，发展检测结果准确、检测灵敏度高的试剂对于重组胰蛋白酶蛋白定量(痕量)的检测具有重要意义，而检测试剂所需的核心原料都是特异性抗原或抗体。

4、基于上述，制备高特异的、灵敏度高的rpt抗体，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可分泌抗重组胰蛋白酶蛋白(rpt)单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种用于检测胰蛋白酶蛋白的试剂盒，所述的试剂盒含有：(i)保藏号为cctcc no:c202321的杂交瘤细胞株(te-5c2d12)分泌的单克隆抗体；和(ii)保藏号为cctcc no:c202320的杂交瘤细胞株(te-1e10a5)分泌的单克隆抗体。

3、在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒中包括：

4、固相载体，所述的固相载体上包被有第一单克隆抗体，所述的第一单克隆抗体选自(i)或(ii)的单克隆抗体；和

5、容器或包装a，所述的容器或包装a中装有第二单克隆抗体，所述的第二单克隆抗体选自(ii)或(i)的单克隆抗体；

6、其中，所述的第二单克隆抗体携带一可检测标记物；或，所述试剂盒包含一可检测标记物、用于与所述第二单克隆抗体连接；

7、其中，所述的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体不相同，且可同时结合于胰蛋白酶蛋白。

8、在一种或多种优选实施方式中，所述的第一单克隆抗体优选(i)抗体，所述的第二单克隆抗体优选(ii)抗体。

9、在一种或多种优选实施方式中，所述的试剂盒中还包含选自以下的一种或多种组件：

10、(a)容器或包装b，所述的容器或包装b中装有胰蛋白酶蛋白的标准品(阳性标准品)；和/或

11、(b)容器或包装c，所述的容器或包装c中装有胰蛋白酶蛋白的质控品；较佳地，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品；

12、(c)容器或包装d，所述的容器或包装d中装有与可检测标记物相对应的底物；

13、(d)容器或包装e，所述的容器或包装e中装有显色剂；

14、(e)容器或包装f，所述的容器或包装f中装有包被液；

15、(f)容器或包装g，所述的容器或包装g中装有洗涤液；

16、(g)容器或包装f，所述的容器或包装f中装有终止液。

17、在一种或多种优选实施方式中，所述的可检测标记物包括(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-d-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

18、在一种或多种优选实施方式中，所述的固相载体包括(但不限于)：孔板(包括微量滴定板)，磁珠，微球，芯片，玻片，试纸。

19、在一种或多种优选实施方式中，所述的试剂盒的线性范围值为0.02-40ng/ml。

20、在一种或多种优选实施方式中，所述的试剂盒的检测灵敏度为0.049ng/ml。

21、在一种或多种优选实施方式中，所述试剂盒为酶联免疫法(elisa)检测试剂盒。

22、在一种或多种优选实施方式中，所述胰蛋白酶蛋白包括重组胰蛋白酶蛋白。

23、在一种或多种优选实施方式中，所述胰蛋白酶蛋白包括氨基酸序列如seq id no:1所示的胰蛋白酶蛋白。

24、在本发明的另一方面，提供特异性结合胰蛋白酶蛋白的单克隆抗体，选自：(i)保藏号为cctcc no:c202321的杂交瘤细胞株(te-5c2d12)分泌的单克隆抗体；(ii)保藏号为cctcc no:c202320的杂交瘤细胞株(te-1e10a5)分泌的单克隆抗体。

25、在一种或多种优选实施方式中，所述的单克隆抗体用于制备检测胰蛋白酶蛋白的试剂盒。

26、在一种或多种优选实施方式中，所述检测包括定量检测、半定量检测或定性检测。

27、在本发明的另一方面，提供产生特异性结合胰蛋白酶蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选自：保藏号为cctcc no:c202321的杂交瘤细胞株(te-5c2d12)；保藏号为cctccno:c202320的杂交瘤细胞株(te-1e10a5)。

28、在本发明的另一方面，提供一种检测胰蛋白酶蛋白方法，所述方法包括以下步骤：

29、(a)将待测样品加样于包被有第一单克隆抗体的固相载体，从而使待测样品中的胰蛋白酶蛋白与固相载体上的第一单克隆抗体结合，形成带有“胰蛋白酶蛋白-第一单克隆抗体”二元复合物的固相载体；

30、(b)将第二单克隆抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二单克隆抗体-胰蛋白酶蛋白-第一单克隆抗体”三元复合物的固相载体；且所述的第二单克隆抗体携带一标记物；

31、(c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中胰蛋白酶蛋白的存在与否以及存在的量；

32、附加条件是：步骤(a)和步骤(b)可依次进行或同时进行；

33、其中，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体选自：保藏号为cctcc no:c202321的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，保藏号为cctcc no:c202320的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；较佳地，所述第一单克隆抗体是保藏号为cctccno:c202321的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，所述第二单克隆抗体是保藏号为cctcc no:c202320的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

34、在一种或多种优选实施方式中，所述检测胰蛋白酶蛋白方法为体外方法。

35、在一种或多种优选实施方式中，所述检测胰蛋白酶蛋白方法为非诊断性的方法。

36、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

技术特征：

1.一种用于检测胰蛋白酶蛋白的试剂盒，所述的试剂盒含有：

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中包括：

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含选自以下的一种或多种组件：

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测标记物包括(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-d-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体包括：孔板，磁珠，微球，芯片，玻片，试纸。

6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的线性范围值为0.02-40ng/ml；和或

7.特异性结合胰蛋白酶蛋白的单克隆抗体，选自：

8.权利要求7所述的单克隆抗体的应用，用于制备检测胰蛋白酶蛋白的试剂盒；较佳地，所述检测包括定量检测、半定量检测或定性检测。

9.产生特异性结合胰蛋白酶蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选自：

10.一种检测胰蛋白酶蛋白方法，所述方法包括以下步骤：

技术总结
本发明提供了特异性结合胰蛋白酶的单克隆抗体及其在检测中的应用。本发明也提供了用于检测胰蛋白酶的试剂盒，其中含有所述的单克隆抗体。所述胰蛋白酶包括重组胰蛋白酶。本发明的单克隆抗体可分别结合于胰蛋白酶的不同表位上，结合位置适当、从而可联合用于实现双抗夹心法的检测，具有高特异性和高灵敏度。

技术研发人员：王鹏
受保护的技术使用者：上海雅心生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5