红鳍笛鲷胶原肽及其制备方法和应用

本发明涉及抗氧化肽的制备，更具体的，涉及红鳍笛鲷胶原肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、氧化应激是自由基生成速率大于清除速率的一种状态，会对细胞内生物大分子如蛋白质、dna和脂质造成损伤。胃肠道与外界环境直接接触使得肠上皮细胞极易受到机械损伤以及病原体和外源化合物的侵袭，打破自由基和机体抗氧化系统之间的平衡，引起氧化应激，进而导致炎症性肠病等消化系统疾病。因此，提高肠道的抗氧化能力对于控制氧化应激相关消化道疾病的发生至关重要。

2、研究表明，来自食品的天然抗氧化肽如蛋清肽、大豆肽可以提升肠道的抗氧化能力并缓解炎症性肠病。食品加工副产品的抗氧化肽因其可持续再利用，易于吸收，高安全性而受到广泛关注。红鳍笛鲷(lutjanus erythropterus)是中国南海重要的经济鱼类，其上等的肉质和极大的市场价值，已经成为中国水产养殖最重要的品种之一，仅在中国北部湾地区捕捞量高达3541吨。红鳍笛鲷鱼在加工中产生大量的鱼鳞，占鱼总重的2％，无法得到充分地利用，不仅降低了红鱼的附加值，更造成了蛋白质的流失，引起环境污染。红鱼鱼鳞中胶原蛋白为ⅰ型胶原蛋白，占鱼鳞总重的20.04％，具有生物相容性、弱抗原性且易降解，是制备胶原肽的良好原料。因此，充分利用鱼鳞不仅对提升产品附加值具有重要的意义，实现红鱼下脚料的高值化利用，也可以解决环境污染问题。事实上，已有以红鳍笛鲷鱼鳞为原料制备胶原肽的相关报道。常规水解方法所需的时间长度限制了胶原肽的大规模生产。因此，为了缩短胶原肽的制备时间，针对红鱼鱼鳞胶原肽制备工艺的理论研究是十分必要的。

3、鱼鳞胶原肽是胶原蛋白酶解纯化后的产物，主要由低分子量的小肽(0.3～8kda)组成，其特殊的氨基酸组成、氨基酸序列以及二级结构，赋予了胶原肽良好的抗氧化活性。肽的氨基酸组成能极大地影响其抗氧化活性。合适的低分子量的胶原肽可以对肽的抗氧化活性产生显著的影响，许多小肽的高级结构较少，它们的抗氧化基团更容易暴露在分子的外部。肽的二级结构在影响肽的抗氧化性能方面起着重要的作用，蛋白质的结构修饰和展开引起的抗氧化氨基酸的暴露，从而提升肽的抗氧化活性。虽然红鳍笛鲷鱼鳞胶原肽的抗氧化活性在其他文献中已有报道，但是目前缺乏红鳍笛鲷鱼鳞胶原肽完整肽结构及其对抗氧化活性的影响的研究。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，提供一种红鳍笛鲷胶原肽lscp-ⅰ的制备方法。

2、本发明的第二个目的是提供红鳍笛鲷胶原肽的应用。

3、本发明的目的通过以下技术方案实现：

4、一种红鳍笛鲷胶原肽lscp-ⅰ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5、s1、对鱼鳞进行前处理，得到明胶；

6、s2、将明胶按照1％的料液比浸泡在离子水中，待明胶完全溶解，采用复合蛋白酶进行酶解，酶解后加热使酶失活，离心冷冻干燥后得到胶原肽粗提物；酶解条件：水解时间2.26h；温度54.03℃；ph为5.93；酶剂量125u/ml；

7、s3、将胶原肽粗提取物经过3kda和8kda mwco膜超滤后得到红鳍笛鲷胶原肽；

8、s4、选取mw<3kda的组分进行冷冻干燥得到红鳍笛鲷胶原肽lscp-ⅰ。

9、本研究以红鱼鱼鳞为原料，以dpph清除率为指标，通过响应面法优化制备胶原肽的最佳酶解参数。采用分子对接技术筛选lscp-ⅰ中有抗氧化潜力的小分子肽。

10、优选地，s1鱼鳞的前处理操作为：将鱼鳞剪碎后用蒸馏水清洗，以0.1m naoh，w/v1:10搅拌鱼鳞脱除杂蛋白，冲洗鱼鳞直至中性；以0.5m hcl，w/v 1:10搅拌鱼鳞脱除灰分；再次冲洗鱼鳞直至中性；将前处理后的鱼鳞在80℃蒸馏水下加热1h，过滤得到滤液，离心后得到上清液，将上清液冻干、保存。

11、本发明对制备得到的lscp-ⅰ进行抗氧化活性评价，结果显示，lscp-ⅰ表现出强的抗氧化能力，强的还原能力以及羟基自由基的清除能力，lscp-ⅰ可以作为一种羟基自由基的清除剂缓解机体氧化损伤。

12、因此，本发明还提供上述方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备抗氧化剂中的应用。

13、本发明还提供胶原肽lscp-ⅰ在制备预防/缓解/治疗细胞氧化损伤的药物中的应用。

14、优选地，所述胶原肽lscp-ⅰ能够保护ice-6细胞免受氧化应激损伤，其中胶原肽lscp-ⅰ的浓度为400～1600μg/ml。

15、结肠长度缩短、体重减轻、便血以及腹泻是dss诱导的uc小鼠的主要表观特征，在结肠组织病理学上表现为粘膜损伤、炎症浸润、杯状细胞的减少和隐窝的消失。本研究的结果表明，口服lscp-ⅰ改善了uc小鼠的结肠萎缩、体重减轻、便血以及腹泻等症状，改善了结肠组织病理学，表明lscp-ⅰ对dss诱导的uc小鼠具有保护作用。

16、因此，本发明还保护胶原肽lscp-ⅰ在制备预防/缓解/治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

17、本发明还保护胶原肽lscp-ⅰ在制备改善小鼠结肠组织损伤的药物中的应用。

18、本发明还保护胶原肽lscp-ⅰ在制备改善小鼠肠道通透性的药物中的应用。

19、本发明还保护胶原肽lscp-ⅰ在制备改善小鼠结肠组织炎症因子水平的药物中的应用，其特征在于，所述炎症因子为tnf-α、il-6、il-1β和il-10。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、为获取红鱼鳞明胶中的抗氧化肽(lscps)，并解析其对h2o2诱导ice-6细胞氧化损伤的保护机制。以dpph清除率为指标利用响应面优化明胶酶解液的制备条件，并采用超滤膜分离得到lscp-i，通过h2o2诱导的ice-6细胞氧化损伤模型评价lscp-i的抗氧化活性。最佳酶解条件为：明胶浓度为1％，水解时间2.26h，温度54.03℃，ph为5.93，酶剂量125u/ml。超滤组分lscp-ⅰ中含有较多的疏水性氨基酸及芳香族氨基酸。gsh含量、sod活性的增加，ros、mda含量的降低，可能是lscp-ⅰ对h2o2介导的氧化损伤ice-6细胞的保护作用的原因。总之，lscp-ⅰ具有较强的抗氧化能力，对细胞损伤具有较好的保护作用。

22、本发明还通过dss建立的uc小鼠模型，探明了lscp-ⅰ对uc小鼠肠道的保护作用，得出以下结论：(1)lscp-ⅰ改善了uc小鼠的症状，改善了结肠黏膜结构完整性。(2)lscp-ⅰ抑制了结肠炎症因子的分泌，降低了结肠中氧化应激水平、并改善了uc小鼠的肠道通透性。

23、本研究为鱼鳞肽的开发利用，以及为有效预防细胞损伤提供理论参考和数据支撑。

技术特征：

1.一种红鳍笛鲷胶原肽lscp-ⅰ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1鱼鳞的前处理操作为：将鱼鳞剪碎后用蒸馏水清洗，以0.1m naoh，w/v 1:10搅拌鱼鳞脱除杂蛋白，冲洗鱼鳞直至中性；以0.5mhcl，w/v 1:10搅拌鱼鳞脱除灰分；再次冲洗鱼鳞直至中性；将前处理后的鱼鳞在80℃蒸馏水下加热1h，过滤得到滤液，离心后得到上清液，将上清液冻干、保存。

3.权利要求1或2任一方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备抗氧化剂中的应用。

4.权利要求1或2任一方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备预防/缓解/治疗细胞氧化损伤的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胶原肽lscp-ⅰ能够保护ice-6细胞免受氧化应激损伤，其中胶原肽lscp-ⅰ的浓度为400～1600μg/ml。

6.权利要求1或2任一方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备预防/缓解/治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

7.权利要求1或2任一方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备改善小鼠结肠组织损伤的药物中的应用。

8.权利要求1或2任一方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备改善小鼠肠道通透性的药物中的应用。

9.权利要求1或2任一方法得到的胶原肽lscp-ⅰ在制备改善小鼠结肠组织炎症因子水平的药物中的应用，其特征在于，所述炎症因子为tnf-α、il-6、il-1β和il-10。

技术总结
本发明属于抗氧化肽的制备技术领域，公开了红鳍笛鲷胶原肽及其制备方法和应用。红鳍笛鲷胶原肽最佳酶解条件为：水解时间2.26h；温度54.03℃；pH为5.93；酶剂量125U/mL。LSCP‑Ⅰ具有较强的抗氧化能力，对细胞损伤具有较好的保护作用。本发明还通过DSS建立的UC小鼠模型，探明了LSCP‑Ⅰ对UC小鼠肠道的保护作用，得出以下结论：(1)LSCP‑Ⅰ改善了UC小鼠的症状，改善了结肠黏膜结构完整性。(2)LSCP‑Ⅰ抑制了结肠炎症因子的分泌，降低了结肠中氧化应激水平、并改善了UC小鼠的肠道通透性。本研究为鱼鳞肽的开发利用，以及为有效预防细胞损伤提供理论参考和数据支撑。

技术研发人员：邓旗,黄家宝,蒲月华,彭千芊,房志家,孙力军
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5